Наш протокол помогает следователям внедрять стандартизированные экспериментальные трубопроводы для выполнения фенотипической характеристики аналогичных популяций путем иммунофлуоресцентного окрашивания. С помощью этого метода исследователи могут тщательно анализировать аналогичный состав сложных тканей болезни и выполнять качественный и количественный анализ фенотипов типов клеток, представляющих интерес. Демонстрацией процедуры будет Сидни Махан, техник из моей лаборатории.
Чтобы подготовить животное к сбору брахиоцефалической артерии, разрежьте брюшной полости до грудины, заботясь, чтобы не повредить брюшной ткани. И сделать два разреза в середине подмыслия линии через грудную клетку, заботясь, чтобы не повредить сердце и легкие. Затем перережьте диафрагму, чтобы частично разоблачить сердце.
Чтобы обильное мышь, установить гравитационную систему изобилия так, что давление обильной жидкости эквивалентно среднему кровяному давлению мурина, чтобы обеспечить последовательное изобилие и поддержание морфологии сосуда. Затем обильное животное с пятью миллилитров комнатной температуры PBS, 10 миллилитров 4%комнатной температуры paraformaldehyde, и пять дополнительных миллилитров комнатной температуры PBS. Подключите 23 или 25 калибровочных игл бабочек к системе изобилия гравитации, и запустить PBS через иглу, чтобы изгнать воздух из труб, прежде чем вставить иглу в левый желудочек.
После обеспечения иглы на месте, используйте ножницы радужной оболочки глаза, чтобы сделать менее двух сантиметров разрез в правом атриуме. Урожай тканей, представляющих интерес в свежем 4%paraformaldehyde. Чтобы разоблачить брахиоцефалической артерии, использовать ножницы, чтобы сделать разрез вниз по средней линии грудины через манубрий и использовать щипцы тянуть обе стороны грудной клетки, чтобы полностью открыть грудную полость.
Затем поместите животное под рассечение микроскопа, чтобы частично визуализировать сонной артерии, и использовать тонкие пинцеты, чтобы вытащить мышцы, соединительной ткани и жира, пока правой сонной, брахиоцефалической артерии, субклавианской бифуркации, и аорты арки очищаются и изолированы от окружающих соединительной ткани и жира. Затем используйте типсы, чтобы захватить правый сонной ниже его бифуркации и сделать первоначальный разрез выше типсов. Тем не менее, держа сонной артерии, сделать второй разрез через подклавианскую артерию и сделать последние два прорезает аорты арки по обе стороны от брахиоцефалии артерии.
Затем соберите любые другие сосудистые ткани, представляющие интерес, и поместите брахиоцефалическую артерию и другие ткани в раствор 4%paraformaldehyde на ночь при комнатной температуре. Для иммунофлуоресцентного окрашивания брахиоцефалической артерии используйте микротом для получения 10 микрометровых секций через образец ткани, встроенный в парафин, пока не будет подтверждена световая микроскопия, через которую была прорезана аортическая арка и видна брахиоцефалическая артерия. Отрегулируйте ориентацию блока до тех пор, пока ткань не будет полностью перпендикулярна лезвию микротомы и не получит три серийных участка толщиной 10 микрометров брахиоцефалической артерии на стеклянную горку до тех пор, пока не будет достигнута субклавианская бифуркация.
Когда все разделы были собраны, гидрат образцов тканей под химическим капюшоном с двумя пятиминутными погружениями ксилена, а затем пять минут погружения этанола серии, как указано, и два пятиминутных деионизированных погружений в воду. Далее, инкубировать слайды в антиген поиска раствора, в соответствии со стандартными протоколами, а затем нагрева в микроволновой печи в течение 20 минут. После одного часа остыть при комнатной температуре, использовать гидрофобные перо, чтобы окружить каждую часть ткани.
И блокировать любые неспецифические связывания с блокированием буфера в течение одного часа при комнатной температуре. В конце инкубации, этикетки образцов ткани на ночь при четырех градусах по Цельсию с основным антителом коктейль интерес, или изотип соответствует IgG контроля антител. На следующее утро, мыть слайды три раза в PBS в течение пяти минут за стирку, а затем один час инкубации в соответствующих флуоресценции конъюгированных вторичных антител коктейль и DAPI для визуализации ядра.
Затем используйте монтажную среду, подходящую для микроскопии флуоресценции, для установки крышки на слайды. Для конфокального микроскопии изображений помеченных секций тканей используйте секции, окрашенные контролем IgG и первичными антителами, чтобы установить чувствительность детектора, лазерную мощность и смещение для каждого отдельного канала. Затем установите верхние и нижние позиции для приобретения z-stack и определите толщину и количество стеков, которые будут изображены.
Когда все изображения были приобретены, откройте изображения в ImageJ и откройте панель инструментов канала и псевдо-цвет различных каналов окрашивания. Слияние цветных каналов. Все каналы должны быть видны на одном изображении.
Включите и выключите отдельные цветные каналы в панели инструментов канала и нажмите правой кнопкой мыши на значок подсчета, чтобы выбрать многоостростной инструмент. Дважды нажмите на значок подсчета, чтобы открыть панель инструментов точки и выбрать тип и размер элементов, используемых для подсчета ячеек. Проверьте все и включите канал DAPI только в панели инструментов канала.
Затем выберите счетчик канала ноль и нажмите на отдельные ядра, которые будут помечены, прокрутки через z-стеки, чтобы подсчитать все ядра окрашены в пределах области интересов. Количество количественных одноклеточных событий будет указано ниже в панели точечных инструментов. Когда все ядра были помечены, включите другой канал окрашивания и выберите встречный канал один, чтобы пометить клетки, в которых есть колокализация между DAPI и окрашивание антител.
Для цитоплазмического окрашивания выберите клетки с окрашиванием вокруг ядра по всей глубине ядра, проверяя несколько z-стеков по мере необходимости. Результаты могут быть выражены как количество ячеек к общему числу положительных ячеек DAPI, или количество ячеек на область в пределах области, представляющие интерес. Иммунофлуоресцентное окрашивание антителами, нацеленными на фенотипические маркеры, как попродемонстрировано, позволяет получать изображения каждого отдельного маркерного окрашивания и дифференциального интерференционного контраста для разграничения областей, представляющих интерес для подсчета одной клетки.
Одиночная клетка подсчитывая для того чтобы обусловить обилие по-разному ровных населенностей клеток мышцы-производных можно после этого выработать используя ImageJ. Например, анализ одного клеточного подсчета в волокнистой области крышки этих репрезентативных поперечных сечений выявил значительные различия в клеточном составе волокнистой области крышки между мышами, обработанными анти-бета-антителами IL-1, и мышами, обработанными изотипом, сопостоял контроль IgG. Действительно, ингибирование бета-версии IL-1 было связано со снижением YFP-положительных гладких мышечных клеток и увеличением галектина-3-положительных клеток.
Кроме того, было отмечено снижение количества YFP-положительных гладких мышечных альфа-актин-положительных гладких мышечных клеток. В то время как относительное количество гладких мышечных клеток полученных YFP-положительный галектин-3-положительных макрофагов был значительно увеличен в обоих местах брахиоцефалической артерии. Примечательно, что ингибирование бета-версии IL-1 не повлияло на общее количество остеохондрогенных клеток в поражении, или доля гладких мышечных клеток, полученных или макрофагов полученных хондрогеных клеток.
Этот протокол был разработан для повышения строгости и воспроизводимости в анализе атеросклеротических поражений путем стандартизации ключевых шагов, таких как сбор тканей, обработка и раздел, а также подсчет одноклеточных клеток. Этот протокол может быть использован для анализа дополнительных сосудистых кроватей, склонных к представлениям атеросклеротических поражений, включая аорту и корень аорты.
