Наш протокол описывает, как собрать и электрически охарактеризовать пептид-допинг биомембрана, который тесно имитирует состав, структуру и транспортные свойства биологических синапсов и который демонстрирует настраиваемое сопротивление памяти. Этот метод позволяет пользователям оценивать зависимую от активности, устойчивость к памяти и краткосрочную пластичность в инженерных системах в временных масштабах и уровнях возбуждения, имеющих отношение к биологическим синапсам и ионным каналам. Этот метод обеспечивает основу для характеристики биомиметических мембран, содержащих ионные каналы, активированные напряжением, что делает его применимым к характеристике различных процессов клеточного транспорта, в том числе в нейронах.
Наше предложение для новых исследователей заключается в том, чтобы впервые стать опытным в подготовке липосомных решений и сборки капель интерфейса bilayer на проволоки типа электродов. Видя из первых рук процесс дозирования капель и позиционирования на электродах упрощает этот метод для формирования билейера, делая его сразу доступным для всех. Демонстрацией этой процедуры будет доктор Джозеф Наджим, постдок из моей лаборатории.
Для начала подготовьте раствор запасов аламетицина в трубке микроцентрифуга путем растворения порошка пептидов аламетицина в этаноле до конечной концентрации 2,5 миллиграмма на миллилитр. Vortex трубки кратко хорошо перемешать, и хранить раствор бульона в минус 20 градусов по Цельсию морозильник. В 1,5 миллилитровую трубку Safe-Lock добавьте один микролитр раствора запасов аламетицина в 99 микролитров раствора А для достижения окончательной концентрации аламетицина в 13 микромоларах в липосомной подвеске.
Vortex хорошо перемешать. В результате пептидный липосомный раствор является раствором B.Mix 117 микролитров раствора А с 10 микролитров раствора В для достижения окончательной концентрации аламетицина одного микромолара, а затем вихря, чтобы хорошо перемешать. Обратитесь к полученному раствору как C.Store решения B и C при четырех градусах Цельсия.
Поместите одну миллиметр толщиной 25 раз 75 миллиметров стеклянной стороны на сцене перевернутого микроскопа. Выпредельте несколько капель гексадеканового масла на центр стеклянной горки, а затем поместите масляный резервуар прямо на масло на стеклянной горке. Полностью заполните нефтяной резервуар гексадеканным маслом.
Убедитесь, что резервуар расположен над объективом цели. Затем подключите держатель электрода к головной ступени текущего усилителя, установленного на микроманипуляторе. Микроманипулятор сводит к минимуму длину электрода и электрический шум.
Затем смонтировать стеклянный держатель микропайпта со второй серебряно-серебряно-хлоридной проволокой на другой микроманипулятор. Используя микроманипуляторы, располагайте электроды таким образом, чтобы кончики серебристо-серебряно-хлоридных проводов с агарозой полностью погружались в нефтяной резервуар на аналогичной вертикальной плоскости. Выровняйте два электрода и разделте их на несколько миллиметров.
Чтобы сформировать липидный билейлер, перемести электроды вертикально в масляную фазу. Используйте микропипюту для депонирования 200 нанолитров липидного раствора А на каждый из проводов. Подождите три-пять минут, чтобы спонтанная сборка липидных монослойных работ происходила на интерфейсе водяного масла.
Капли могут провисать, если окружающее масло достаточно менее плотное. После этого опустите электроды, чтобы повторно погрузиться, пока концы обоих электродов не коснутся дна нефтяного резервуара. Затем, чтобы сформировать билейер, переместить электроды горизонтально, чтобы привести капли в контакт.
Для получения ущипнул, гистеретические, ток-напряжение отношения, использовать функцию генератора для применения треугольной или синусиновой формы напряжения волн для аламетицин-свободной липидной мембраны, собранной с каплями раствора A.Record индуцированной текущей реакции на нескольких частотах. Для записи размера межфациального липидного бислойного, либо измерить диаметр липидной мембраны на компьютере или записать пик-пик текущей амплитуды в результате 10 герц, 10 милливольт треугольной волны для расчета области мембраны. Возьмите провода из фазы масла, чтобы удалить капли, которые не содержат аламетин.
Добавьте новые акальные капли, используя раствор С и сформив липидный билейзер. Основываясь на амплитуде квадратного волнового тока, используйте микроманипуляторы для регулировки контакта между каплями, так что билайер имеет такую же область, как и ранее. Затем нанесите 10-герц и 10-милливольтную форму волны напряжения и замечаете индуцированную текущую реакцию, как и раньше.
Для проведения импульсных экспериментов с использованием пользовательского программного обеспечения программирования и аналогового источника напряжения, генерировать импульсы напряжения с конкретными высокими и низкими амплитудами вовремя и вне времени. Запись тока в ответ на примененные импульсы. Сюжет тока по сравнению с напряжением показывает ненулевой текущий ответ при применении смещения напряжения к липидного билейзера без аламетицина.
Добавьте 0,017 герц, частота, где в ней доминирует мембранная устойчивость. Низкий ohmic в настоящее время реакция показана для высоки изоляционной мембраны. Участок липидного двуслойного, образованного между двумя каплями, содержащими пептиды аламетицина, показывает экспоненциально увеличиваемые токи при напряжении выше порога вставки в 100 милливольт.
При высоком напряжении пептиды аламетицина, проживающие на поверхности липидного билейера, вставляются в мембрану и агрегируются для формирования проводящих пор. Симметричные текущие реакции на обе полярности обусловлены вставкой и агрегацией отдельных популяций пептидов с противоположных сторон мембраны. Емкостное течение должно быть вычтено из общего тока, чтобы получить только memristive, ущипнул истереза текущего напряжения ответ.
Биомолекулярный memristor ответ на последующие импульсы напряжения с увеличением проводимости вовремя, несмотря на периодические восстановления изоляционного состояния в течение каждого свободного времени. Как нынешний стимул, так и предыдущие стимулы способствуют нынешнему увеличению. Сплоченные монослойные на обеих каплях должны образовываться, прежде чем объединить их, чтобы сформировать билейер.
Если капли собираются слишком рано, они сливаются и не образуется билейер. В настоящее время мы разрабатываем и изготовляем микрофлюидные базовые нейронные сети, состоящие из твердофюсных нейронов, соединенных мембранными синапсами, поддерживаемыми оптимизацией сетевой ассимиляции высококоньких суперкомпьютеров ORNL. Эти memristors являются первыми, чтобы иметь состав, структура, механизм переключения, и ионный транспорт биологических синапсов.
Таким образом, они обеспечивают биомолекулярную основу, меблированную добавление мозговых вычислений и памяти.
