Этот протокол сообщил о преобразовании традиционных электроспун нановофибрембранов из 2D в 3D, путем разгерметизации подкритической жидкости CO2, которая не была реализована ранее. Этот метод устраняет многие проблемы, связанные с предыдущими подходами, в том числе использование aqueous решений и химических реакций, многоступчатые процессы, потеря активности инкапсулированных биологических молекул, а также ограничения гидрофобных полимеров. Демонстрация этой процедуры Shixuan Чэнь, postdoc из моей лаборатории.
В стеклянной трубке на 20 миллилитров растворяют два грамма ПХЛ в растворительной смеси дихлорметана и DMF, при соотношении 4 к одному при концентрации 10 процентов. Поместите стеклянную трубку в лабораторный ротатор до тех пор, пока раствор не станет ясным. Раствор может смешиваться в течение ночи.
Чтобы настроить электроспиннинг аппарат, во-первых, добавить pcL решение 20 миллилитров шприц с 21 калибровочный тупой иглой прилагается. Убедитесь, что в шприце нет воздуха, а также диссоциированные трубки. Поместите вращающийся стальной барабан с наземным коллектором в 12 сантиметрах от кончика иглы.
Используя зажимы аллигатора, подключите к игле высоковольтный источник питания прямого тока и убедитесь, что коллектор заземлен. Для 20 миллилитров раствора PCL установите параметр шприц-насоса диаметром 20,27 миллилитров и скоростью потока 0,5 миллилитров в час. Проверьте, формируются ли капли на кончике иглы.
Нанесите электрический потенциал в 20 киловольт между спиннеретом и наземным коллектором, расположенным в 20 сантиметрах от спиннерета. Соберите выровненные нановофиберные коврики в барабане, вращаясь при 2000 об/мин. Соберите коврики PCL нановонфиль, как только они достигнут толщины около одного миллиметра.
Погрузите коврики ПХЛ нановонфиль в жидкий азот в течение пяти минут. Храните коврики pcL нановонфиль в жидком азоте и пробивай коврики из нановофиберы PCL ударом диаметром 0,5 миллиметра. Поместите коврики ПХЛ нановонфиль в жидкий азот в течение пяти минут.
Разрежьте коврики на один сантиметр на один сантиметр квадратов с помощью острых хирургических ножниц во время погружения в жидкий азот, чтобы избежать деформации краев. Поместите разрезанный коврик в 30-миллилитровую центрифугу с примерно одним граммом сухого льда. Плотно крышка крышки, и позволяют сухой лед, чтобы превратиться в жидкий углекислый газ.
Как только жидкость образуется в трубке, быстро отпустите давление, открыв крышку. Удалить и наблюдать пыхтел эшафот из трубки. Поместите эшафот в новую центрифугу трубки с сухим льдом, и повторить util желание толщина достигается.
Стерилизовать расширенные нановофиберные леса в оксиде этилена до инкубации с клетками. Эффективность расширения традиционных 2D электроспун нановофиберных ковриков в 3D леса через разгерметизацию субкритической жидкости CO2 показана слева после второй обработки. Толщина эшафота увеличилась с одного миллиметра при отсутствии лечения до 2,5 миллиметра при одной обработке CO2, до 19,2 миллиметра с двумя обработками CO2.
Пористость лесов увеличилась с 79,5 процента для необработанных ковриков, до 92,1 процента после первого лечения, до 99,0 процента после второго лечения. Это важно, потому что степень проникновения клеток в эшафот, и, таким образом, его эффективность, чтобы вызвать регенерацию, в значительной степени зависит от пористости. Sem изображения показывают, что плотно упакованные фибулярной структуры необработанных 2D коврики были преобразованы в упорядоченные, слоистые структуры с выровненными нановолокна после расширения с CO2.
В Vevo исследования были проведены подкожной имплантации CO2-расширенных нановолокна леса с квадратными отверстиями для крыс. Это позволяет клеточной миграции и пролиферации в отверстиях, а также дальнейшее проникновение в слои нановолокна, которые были созданы во время расширения. С первой по четыре недели после имплантации, расширенные леса показали значительное увеличение числа кровеносных сосудов формируется, и многоядерных гигантских клеток по сравнению с традиционными нано волокна коврик.
После этой процедуры различные молекулы, включая факторы роста, аминомодулирующие соединения, гемостатические агенты и антимитокулярные агенты, могут быть включены в коврики из нановолокна и расширены в субкритической жидкости CO2. Такие функциональные расширенные эшафоты нановолокна могут быть использованы для изучения новых вопросов в других научных областях, таких как гемостаз, профилактика и лечение инфекции, иммунология, регенерация и ремонт тканей. Органические растворители токсичны и должны обрабатываться в химическом капюшоне.
Кроме того, контейнер, который может выдержать высокое давление субкритической жидкости CO2 должны быть использованы для расширения.
