Этот метод может помочь выявить различия между грибами и млекопитающими на молекулярном уровне. Такие различия могут быть использованы для выявления новых терапевтических подходов. Основным преимуществом этой техники является то, что она более эффективно модифицирует геном C.Albicans, чем классические гомологичные методы рекомбинации.
Для определения последовательности направляющий РНК определите последовательность NGG PAM, близкую к тому, куда будет вставлен стоп-кодон. Здесь показаны все последовательности PAM, найденные в первых 100 базовых парах TPK2, циклического каталитического подразделения AMP киназы. Определите перемотка вперед руководства три последовательности.
Эта последовательность будет 20 баз непосредственно вверх по течению от сайта NGG PAM и не будет содержать более пяти T в ряд. Слева нажмите на базу прямо вверх по течению от NGG и перетащите курсор 20 баз. Затем слева нажмите на вкладку грунтовки, чтобы добавить грунтовку.
Теперь определите обратное руководство грунтовка три последовательности, которая будет комплимент вперед руководство последовательности. Левая лизать на базе непосредственно вверх по течению от NGG и перетащить курсор 20 баз. Для каждого грунтовки, слева нажмите на вкладку грунтовки, чтобы добавить грунтовку.
Право нажмите грунтовка и выберите копию грунтовка данных. Вставьте последовательности в программу редактирования текста. Добавить свес последовательности вперед и обратное руководство oligos для облегчения клонирования.
Добавьте нуклеотидную последовательность ATTTG к пяти главным концам вперед направляющий грунтовка три и добавить G к трем премьер-конец вперед руководство грунтовка три. Наконец, в нуклеотидной последовательности AAAAC к пяти премьер-конец обратного направляющий грунт три и добавить C к трем премьер-конец обратного руководства грунтовки три перед покупкой. Краситель тест Candida оптимизирован вектор выражения cas9, добавив pv1524, 10x буфер, bs9b1, и вода до 50 микролитров в 1,5 миллилитров трубки и инкубировать при 55 градусов по Цельсию в течение 20 минут.
Охладить смесь пищеварения до комнатной температуры и вращаться в течение 30 секунд при 2348 раз G, чтобы довести конденсат до нижней части трубки. Для phosphatase лечения переваренной позвоночника, добавить один микролитер теленка кишечной Фосфатазы в смесь пищеварения. Инкубировать реакцию при 37 градусах по Цельсию за час до этого.
Теперь, фосфорилат и аннеальный вперед руководство грунтовки три и обратное руководство грунтовки три, объединив их с 10x T4 Ligase Buffer, T4 Polynucleotide Kinase, и вода в трубке ПЦР. Добавьте 10x T4 Ligase Buffer, T4 Polynucleotide Kinase и Molecular Biology Grade Water во вторую трубку ПЦР в качестве отрицательного контроля. Инкубировать реакционной смеси в Thermocycler при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут, затем при 95 градусах по Цельсию в течение 5 минут.
Охладить смесь при самой медленной скорости рампы до 16 градусов по Цельсию, чтобы аннеал олиго. Затем инкубировать анналированную смесь олиго при 4 градусах по Цельсию. Теперь ligate annealed oligos в усваивается PV1524.
В первой трубке ПЦР добавьте 10x T4 Ligase Buffer, t4 DNA Ligase, аннулированную смесь олиго, очищенную плазмидной плазмидой CIP и воду к 10 микролитровому объему. Аналогичным образом подготовить вторую трубку ПЦР, используя смесь отрицательного контроля вместо annealed олиго смеси. Инкубировать обе трубки в Thermocycler при 16 градусах по Цельсию в течение 30 минут, затем при 65 градусах по Цельсию в течение 10 минут, и, наконец, остыть до 25 градусов по Цельсию.
После перевязки, трансформировать перевязочные смеси в химически компетентных клеток, а затем очистить и последовательности плазмиды, как описано в текстовом протоколе. Чтобы спроектировать шаблон ремонта, вставьте стоп-кодон слева, нажав в последовательности генов и добавив нуклеотиды, которые кодируют стоп-кодон и место пищеварения ограничений. Слева нажмите 10 баз вниз по течению, где мутация будет сделано и перетащите курсор 60 баз вверх по течению.
Левая лизать на грунтовке вкладку, чтобы добавить грунтовку. Это добавит шаблон ремонта вперед три. Затем слева нажмите 10 баз вверх по течению, где мутация будет сделано и перетащить курсор 60 баз вниз по течению.
Левый нажмите на вкладку грунтовки, чтобы добавить грунтовку. Это добавит шаблон ремонта обратной три. Чтобы создать шаблон ремонта, добавьте шаблон ремонта вперед грунтовки, ремонт шаблона обратной грунтовки, дезоксиноклетид трифосфаты, буфер, полимераза TACH, и вода для каждой из четырех труб PCR.
Теперь выполните расширение грунтовка, выполняя от 20 до 30 раундов ПЦР. Чтобы переварить правильно клонированные плазмиды, добавьте плазмиду, 10x буфер, бовиновый сывороточный альбумин, KPN 1, SAC 1 и воду до 40 микролитров общего объема в 1,5 миллилитровой трубке. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию за одну ночь.
Между тем, расти ночь культуры C.albicans SC5314, дикого типа прототроф, при 25 градусов по Цельсию в уридин дополняет YPD. Вырастите культуру до оптической плотности на 600 нанометров или OD 600 менее шести. Пеллет пять OD 600 единиц клеток на преобразование, вращаясь в течение пяти минут в 2348 раз G.Then приостановить гранулы клеток в 100 микролитров TE / Литий ацетат.
Теперь, к 1,5 миллилитровой трубке и в порядке, добавьте повторно приостановленные клетки, вареную и быстро охлажденную ДНК спермы лосося, пищеварение плазмы, очищенный шаблон ремонта и буфер пластины. Подготовье отрицательного контроля таким же образом, за исключением замены воды в объеме, равном объему преобразования ДНК. После инкубации преобразований на ночь, тепло патрон клеток, поместив их в 44 градусов по Цельсию водяной бане в течение 25 минут.
Спин в течение пяти минут при 2348 раз G в скамейке верхней центрифуги и удалить пластины смеси supernatant. Вымойте один раз, добавив один миллилитр Уридина Дополненные YPD и центрифуги снова. После приостановки клеток в 0,1 миллилитра Уридина Дополненный YPD, инкубировать подвеску на роликовый барабан или шейкер при 25 градусов по Цельсию на ночь.
На следующий день, пластины клеток на Уридин Дополненный YPD с 200 микрограмм на миллилитр нурсеотроцина. Колонии появятся через два-пять дней и должны быть полоса для одиночных колоний, как описано в текстовом протоколе. Для выполнения колонии PCR, дизайн вперед проверить грунтовку около 200 базовых пар вверх поток ограничения сайта, который был введен, а также обратный грунтовка около 300 базовых пар вниз по течению.
Добавьте в трубку 0,3 микролитера форвардной проверки грунтовки, 0,3 микролитров грунтовки обратной проверки, 0,3 микролитера термостабийной полимеразы, три микролитров dNTP, три микролитров буфера XTAC и 23 микролитров воды. Затем добавьте 0,25 микролитров одной дрожжевой колонии в смесь с помощью наконечника пипетки P10 и заботьтесь о том, чтобы не беспокоить ager. После усиления ДНК ПЦР, запустить пять микролитров ПЦР на гель для обеспечения усиления является успешным, заботясь, чтобы не беспокоить гранулы клеточного мусора в нижней части трубки.
Здесь показаны репрезентативные результаты редактирования генома CRISPR при посредничестве C.Albicans. C.Albicans был преобразован с руководством РНК и ремонт шаблонов, которые ориентированы на C.Albicans TPK2. Сайт пищеварения ограничения EcoR1 и стоп-кодоны в шаблоне ремонта нарушают работу сайта PAM и облегчают скрининг на правильных мутантов.
Колония ПЦР с последующим ограничением пищеварения быстро отличает дикий тип от отредактированных последовательностей. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы проверить несколько копий руководства РНК клонированы в PV1524. Так как это снизит эффективность редактирования генома.
Не забывайте, C.Albicans является патогеном BL2, и всегда, где соответствующие лабораторные наряды и следовать всем процедурам безопасности при выполнении этой процедуры.
