Этот протокол фокусируется на двух химических методов сушки, Hexamethyldisilazane и T-бутил алкоголя и их применения изображений как прокариотических и эукариотических организмов с использованием SEM. Основным преимуществом этого метода является то, что он не требует использования специализированного сушильной оборудования, такого как сушилка критической точки для подготовки образцов для анализа. Этот протокол описывает методы использования химического обезвоживания и SEM анализа трех типов организмов, но будет широко применимы к изучению многих типов организмов и тканей.
Демонстрацией процедуры будет Мэдисон Кун, студентка моей лаборатории. Для начала приготовьте цианобактерии с помощью ночной фиксации. Затем перенесите их в фильтр фильтрации 10 мл, содержащий поликарбонатный фильтр 25 мл.
Печать боковой и воронки фильтрационой установки с резиновыми пробками, чтобы содержать культуру в воронке. После удаления обеих пробок удалите фиксатор, нежно пылесосив на фляжних флях. Чтобы подготовить одноклеточные водоросли эугленоиды, исправить их, добавив 3 капли 4%osmium тетроксида непосредственно к культуре, которая ранее была передана в 10 мл фильтрации установки.
После 30-минутной инкубации удалите обе пробки и удалите фиксатор, нежно пылесосив на фляжних флях. Вымойте фиксированные эвгленоиды три раза с 5 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,0 при комнатной температуре в течение десяти минут каждый, сохраняя колбу и воронку закрытыми с пробками, чтобы держать стирку. После удаления обеих пробок, удалите каждую стирку нежным вакуумом на фильтрационой колбе.
Чтобы обезвоживать образец при сохранении непрерывного погружения, используйте градуированный этанол серии в течение десяти минут в объеме 5 мл в воронке, сохраняя колбу и воронку закрыты с пробками, чтобы содержать этанол в воронке. После удаления обоих пробки осторожно вакуум на фильтрационную колбу, чтобы удалить этанол. Перенесите образец на одноразовое алюминиевое блюдо весом, содержащее достаточно 100% этанола, чтобы покрыть образец.
Для выполнения химической сушки эугленоидов с помощью TBA, сначала замените 100%-ный раствор этанола в алюминиевой тарелке с 1 к 1 раствором TBA и 100% этанола в течение двадцати минут. Затем замените решение 1 к 1 на 100% TBA в течение двадцати минут и повторите процесс дважды. Удалите TBA и замените достаточно свежим 100%TBA, чтобы покрыть образец.
Поместите блюдо при четырех градусах по Цельсию в течение десяти минут, чтобы заморозить TBA. Перенесите образец в вакуумный децикатор с замороженными пакетами геля, чтобы сохранить TBA замороженным. Используйте роторный насос для эвакуации и поддержания вакуума, чтобы позволить образцу высохнуть путем вакуумной сублимации замороженных TBA, по крайней мере три часа.
Чтобы смонтировать цианобактерии в эугленоидах, обозначить дно 25-мм алюминиевой крепления заглушки, чтобы указать, что находится на вершине. Затем поместите каждый фильтр на углеродной клей вкладке закреплены в верхней части заглушки. Чтобы подготовить Drosophila melanogaster, погрузите анестезированных мух в 1 мл фиксатора в течение двух часов при четырех градусах по Цельсию, убедившись, что они полностью погружены.
Используйте стеклянную пипету для удаления фиксатора. Вымойте фиксированный образец дрозофилы в микроцентрифуге 1,5 мл трубки три раза с 1 мл 0,1 м фосфатного буфера, рН 7,2 при комнатной температуре в течение десяти минут. Используйте стеклянную пипетку, чтобы удалить каждую стирку, будьте осторожны, чтобы не удалить образец.
Затем обезвоживайте образец в микротрубке в объеме 1 мл, используя градуированный этанол серии в течение десяти минут каждый. Используйте стеклянную пипетку, чтобы удалить каждую стирку, будьте осторожны, чтобы не удалить образец. Храните образец в 1,5 мл микроцентрифуг трубки с достаточно 100% этанола, чтобы покрыть его.
Для выполнения химической сушки мух с помощью HMDS, сначала замените 100%ethanol раствор с 1 до 2 раствор HMDS и 100% этанола в течение двадцати минут. Затем замените раствор 2 к 1 раствором HMDS и 100% этанола в течение двадцати минут. Наконец, замените это решение на 100%HMDS в течение двадцати минут, а затем повторите процесс один раз.
Перенесите образец, который находится в 1,5 мл микро центрифуги трубки и HMDS в одноразовые алюминиевые взвешивания блюдо. Замените 100%HMDS на достаточно свежие 100%HMDS, чтобы покрыть образец. Поместите образец в алюминиевое блюдо непосредственно в химический капот дыма, чтобы высохнуть с свободной крышкой, такой как коробка, чтобы предотвратить падение мусора на образец и дать ему высохнуть в течение 12 до 24 часов.
Чтобы смонтировать Drosophila, этикетка нижней части алюминиевой крепления заглушки. Используйте точные пинцеты, чтобы поместить высушенных мух в нужное положение на углеродной клейкой вкладке, закрепленной в верхней части заглушки под рассеченным микроскопом. Нанесите серебристый проводящий клей по внешним краям заглушек.
Используйте зубочистку, чтобы соединить серебряную краску с мухами, обеспечивая проводимость, убедившись, что краска не касается желаемой области изображения. Поместите заглушки в коробку держатель заглушки, а затем поместите открытую коробку держатель заглушки в desiccator и дайте серебряной краской высохнуть, по крайней мере три часа. Для подготовки аппарата покрытия распыления выполните от 4 до 5 смывов аргонового газа.
В зависимости от образцов, которые должны быть покрыты, установите таймер на различные настройки, описанные в рукописи. Sputter пальто заглушки в соответствии с инструкциями производителей. Наконец, образцы изображений с помощью сканирующего электронного микроскопа, который включает в себя вторичный детектор электронов с настройками, которые зависят от используемого образца.
Успешная подготовка цианобактерий для СЭМ с помощью этого протокола дала изображения, на которых видны детали клетки, включая форму и текстуру поверхности, а также оболочку mucilage и проекции из клеток. SEM изображение нитей пресноводных видов из Колорадо показывает видимые оболочки mucilage. SEM изображение пресноводных бактерий из Огайо показывает отдельные клетки, которые иногда образуют колонии, удерживаемые тонким слоем mucilage.
Нити, как выступы простираются от отдельных клеток. Изображения неизвестных нитевых видов из лимана высокой солености в прибрежных водах Техаса показывают отдельные и разделяющие клетки. SEM был использован для визуализации полоски пелликулы двух различных видов euglenoid.
При сравнении Monomorphina и Aenigmatica с Monomorphina псевдо пирум, видимые helical расположение pellicle полосы, которые появляются на заднем конце, чтобы сформировать хвост, помощь в филогении к прекращению. SEM изображения нормальных глаз drosophila показывают упорядоченный массив щетины и линз, но экспрессия белков, связанных с болезнью Альцгеймера создать грубый фенотип глаз. Гены, которые подавляют или усиливают фенотип грубых глаз, могут играть физиологическую роль в прогрессировании заболевания.
Вот примеры потенциальных ям падает, чтобы избежать, в том числе пример рухнул структуры глаза от неправильной техники сушки и электронной зарядки от недостаточного кодирования распыления, который появляется во время приобретения изображения. Протоколы, описанные здесь использовали организмы, которые очень сильно с уважаемым соучастием, но все они подотменны для анализа SEM для сбора полезной, морфологической информации, которая имеет решающее значение для научных открытий, охватывающих многие суб дисциплины биологии. Не забывайте, что работа с T-Бутил алкоголя, Hexamethyldisilazane, и осмий тетроксид может быть опасным и соответствующие меры безопасности всегда должны соблюдаться для защиты пользователей, особенно студентов, которые будут обрабатывать эти химические вещества.
