В протоколе представлены различные методы микроскопии, применяемые для понимания грибковой колонизации в микогетеротрофных растениях, от сбора до подготовки образцов в деталях и включают основные этапы. Такие методы могут быть применены к различным микогетеротрофическим растениям и даже к растительным материалам, отличным от микогетеротрофики. Этот метод в основном связан со структурной ботаникой, а также может дать представление о микоризных взаимодействиях, физиологии, репродуктивной биологии, эволюции и экологии микогетеротрофных растений.
Для начала соберите микогетеротрофные растения, исследуя почву вокруг основания растения, заботясь о том, чтобы не повредить подземные органы. Кроме того, избегайте вытягивания растений из земли, чтобы предотвратить отключение воздушных органов от подземных. Осторожно копайте вокруг воздушных структур, используя садовый мастерок, исследуя подземные органы, такие как корни, стебли, корневища и органы хранения, не повреждая эти структуры.
Удалите частицы почвы, чтобы сохранить хрупкие структуры и деликатно промыть эти органы водопроводной водой, чтобы смыть оставшиеся частицы почвы перед фиксацией образцов. Микогетеротрофные растения, связанные с опавшими листьями, требуют дополнительного внимания. Следовательно, тщательно собирайте тонкие органы, связанные с разлагающимся материалом через их гифы, не вытягивая их из связанных структур.
Сохраняйте конструкции с такими связями и собирайте подстилку для анализа. Для анализа просвечивающей электронной микроскопии разделите образцы толщиной от 3 до 4 миллиметров внутри капли буфера какодилата натрия глутаральдегида на более мелкие участки толщиной от 1 до 2 миллиметров. Отбросьте обрезанные края за пределы капли.
Обеспечьте проведение процесса фиксации на месте сбора сразу после сбора растений. Немедленно перенесите срезы в сборную трубку с объемом фиксатора более чем в 10 раз превышающим объем образцов, так как он является аддитивно-фиксирующим средством. Для поверхностного анализа поверхностных гиф в органах, особенно в подземных и контактирующих с опавшими листьями.
Наблюдайте за свежим или фиксированным материалом под рассекающим микроскопом при увеличении 7,5x или выше. Поиск областей интересов руководствуется поверхностными гифами и ризоморфами. Выберите образцы, содержащие области поверхностных ризоморфов, поскольку они могут быть разделены для визуализации пелотонов и гиф в корковых клетках в корнях и стеблях.
Готовят 0,2 миллиграмма на миллилитр зародышей пшеницы агглютинина фторхрома конъюгата и 1%калькофтор белого раствора в 0,1 молярном фосфатном буфере, как описано в текстовой рукописи. Теперь высиживают участки на стеклянных горках, правильно покрывая их конъюгатным раствором фторхрома зародышей пшеницы в течение 30 минут. После инкубации промыть участки 0,1 молярной фосфатной буфером и инкубировать их в растворе калькофтора в качестве монтажной среды.
Далее поместите крышку на слайды и наблюдайте за ней под конфокальным или флуоресцентным световым микроскопом с помощью указанных фильтров. После фиксации образцов, выполнения обезвоживания и хранения его в 70% этаноле, обнажите любую желаемую поверхность для сканирования электронной микроскопии, используя острое и новое лезвие бритвы, чтобы сделать разрезы с односторонним движением. При необходимости используйте стереомикроскоп для отбора образцов и учета площади металлических заглушек при определении размеров выборки.
Далее обезвоживают образцы в этаноловом ряду. Поддерживайте мелкие и деликатные образцы в течение 30 минут в каждой концентрации и более крупные и плотные образцы в течение 1 часа. Затем сложите небольшие конверты, используя папиросную бумагу, чтобы организовать образцы для следующих шагов.
Более крупные образцы могут быть обработаны без конверта. Пометьте конверты карандашом и ведите журнал образцов. Осторожно поместите образцы внутрь конвертов с помощью кисти.
Теперь храните эти образцы в абсолютном этаноле. Немедленно приступайте к сушке в критических точках, используя сушилку критической точки в соответствии со стандартными рабочими процедурами. Для этого поместите образцы в абсолютный этанол в держатель для образцов и поместите его в барокамеру сушилки критической точки.
Промежуточная жидкость растворяется в переходной жидкости в критической точке углекислого газа, тем самым высушивая образцы. Поскольку реабсорбция атмосферной влажности может разрушить образцы, храните их в контейнере для высыхания сразу после высыхания в критической точке. Перед установкой образцов на металлические заглушки наденьте перчатки, чтобы манипулировать заглушками.
Погрузите их в ацетон на 5 минут, чтобы удалить жир и дать им высохнуть. Под стереомикроскопом зафиксируйте образцы на заглушке с помощью проводящей двусторонней углеродной клейкой ленты и расположите их. Сайт сверху является единственно возможной перспективой при сканировании изображений электронной микроскопии.
Для манипулирования образцами используйте тонкоточечный пинцет. Часть образца, затронутая пинцетом, обычно повреждается. Поэтому будьте осторожны и попробуйте коснуться частей, расположенных вдали от областей интереса.
Храните заглушки с образцами в герметичной чашке Петри с силикагелем. Затем приступайте к нанесению слоя золота или платины на поверхность образцов в атмосфере низкого давления инертного газа, следуя стандартным рабочим процедурам. Толщина покрытия зависит от топографии образца и обычно составляет от 15 до 40 нанометров.
Наконец, сохраните покрытые оболочкой заглушки в герметичной чашке Петри с силикагелем, удерживающим влажность. Образцы могут храниться таким образом в течение нескольких недель. Используйте сканирующий электронный микроскоп для анализа этих образцов.
Электронный пучок ударяет по образцу in vacuo во время сканирующей электронной микроскопии, и излучение сигнала от такого взаимодействия интерпретируется как изображения. Убедитесь, что растворы и материалы, используемые в симбиотическом прорастании семян, стерильны. во избежание загрязнения.
Начните с автоклавирования их в течение 20 минут при 121 градусе Цельсия. В ламинарной вытяжке с воздушным потоком поверхностно дезинфицируйте плоды и семена, погружая их в раствор гипохлорита натрия, содержащий 2% активный хлор. Тонкие и хрупкие семена можно погружать в разбавленный раствор гипохлорита натрия 1:1.
После дезинфекции восстановите семена, отфильтровав их с помощью ксерографической ткани. Трижды вымойте плоды и семена в автоклавной дистиллированной воде, чтобы удалить раствор гипохлорита, прежде чем приступать к испытаниям на прорастание. При необходимости храните их в конвертах из фильтровальной бумаги внутри стеклянных колб с силикагелем при температуре 4 градуса Цельсия и герметично закрывайте колбы и запечатывайте их пищевой пленкой, затем оцените эффективность процесса промывки, переведя несколько капель воды с последней промывки в картофельный декстрозный агар.
Для симбиотического прорастания семян орхидеи инкубируют семена на 1-2 сантиметрах автоклавных дисков из фильтровальной бумаги, помещенных в чашки Петри, содержащие овсяную овсяную акаровую культуральную среду. Теперь привить центр чашки Петри фрагментом питательной среды, содержащей мицелий из выбранного изолированного гриба. Запечатайте чашки Петри пищевой пленкой и высиживайте их в темноте при температуре около 25 градусов цельсия или комнатной температуре, в зависимости от роста грибков.
Приготовьте некоторые блюда с семенами и без грибковой прививки в качестве отрицательного контроля для теста на прорастание. Еженедельно анализируйте результаты всхожести, собирая количественные и качественные данные и фотографируя протокормы и саженцы. Ризоморфы могут быть легко распознаны, как правило, как темные, похожие на шнурки структуры.
От руки или другие методы получения участков толщиной более 10 микрометров могут лучше демонстрировать пелотоны и предоставлять более репрезентативные изображения грибковых паттернов колонизации. Секции от руки также могут быть пригодны для анализа гиф в более высокой амплификации. Хотя, детали лучше достигаются на более тонких участках.
Вторичные клеточные стенки в элементах ксилемы могут быть легко идентифицированы по светлому цвету, который приобретает толуидин. Между тем, элементы флоэмы, состоящие только из первичных клеточных стенок, идентифицируются по их более тонким и темным клеточным стенкам. Артефакты автофлуоресценции можно увидеть в гликолевых срезах метакрилатной смолы.
Эти артефакты обычно связаны с концентрацией фторхрома и их можно избежать, промывая образцы большим количеством раз буфером. Раздел корня от руки показывает внутренние и внешние гифы. Этот же орган можно увидеть при сканирующей электронной микроскопии с обилием ризоморфов и отдельных гиф на его поверхности.
Большинство видов орхидей прорастают в течение нескольких недель после заражения привитым грибком или почти до более чем месяца. Свет в сканирующей электронной микроскопии может быть применен к цветам, фруктам и семенам для исследования репродуктивной биологии или микогетеротрофных растений. Симбиотическое прорастание семян также может быть проверено на автотрофных орхидеях.
