Этот протокол продемонстрировал простой и продукуемый метод оценки фагоцитозной способности макрофагов с использованием EGFP-экспрессии кишечной палочки. Здравствуйте, меня зовут Джун-ю из Второй больницы Даляньского медицинского университета. Сегодня мы собираемся показать вам легко и визуализировать способ оценки макрофаг фагоцитоза, который можно легко сделать в течение двух часов.
Этот метод широко использовался при изучении врожденной иммунной функции. Считается, что врожденная иммунная функция осталась нетронутой у пожилых людей. Поэтому сегодня мы собираемся изолировать перитонеальные макрофаги от пожилых и молодых мышей и увидеть фагоцитическую способность этих двух групп.
Ну, давайте начнем. Во-первых, синтезировать фрагмент гена EGFP и клонировать фрагмент с помощью высокой точности Taq ДНК полимеразы. Затем завягайте продукт ПЦР в вектор PET SUMO.
В-третьих, трансформировать перевязочные продукты в штамм E.coli и вызвать EGFP экспрессии с лактозой. Эти EGFP-выражение E.coli служил маркером для анализа фагоцитоза. Затем, мышь peritoneum макрофаги были изолированы и культурные.
Затем, EGFP-выражая E.coli были coincubated с макрофагами в течение одного часа при 37 градусов centigrees. После закалки макрофаги были готовы к оценке как флуоресцентный микроскоп, так и цитометр потока. Синтезировать фрагмент гена EGFP и усилить фрагмент с помощью вперед и пять грунтовки с использованием высокой точности Taq ДНК полимеразы.
Для обеспечения того, чтобы продукты ПЦР имели одиночные трехкурсные аденин-свесы для клонирования TA на следующем этапе, рекомендуется 30-минутное расширение на 72 градуса цельсия после последнего цикла. Проверьте продукт ПЦР с помощью электрофорезов агарозного геля. Если фрагмент был усилен правильно, 717 bp полоса может наблюдаться на гель.
Клонировать продукт ПЦР в вектор pET SUMO с помощью метода клонирования TA с помощью лигозы ДНК T4. Инкубировать реакцию при комнатной температуре в течение 30 минут. Добавьте пять микролитров продукта ПЦР в 100 микролитров компетентных клеток BL21.
Тепло удар клеток на 42 градусов градусов в течение 90 секунд, а затем держать смесь на льду в течение трех минут. Добавьте 400 микролитров ЛБ среднего, разогретого при 37 градусах градусов. Встряхивание один час при 37 градусах градусов и 120 об/мин.
Прививка бактерий на поверхности пластины LB с 100 микрограмм на миллилитр канамицин для проверки вектор-преобразованный E.coli. Инкубировать пластину в 37 градусов градусов градусов духовке на ночь. На следующий день, привить положительную колонию в пять миллилитров LB сми со 100 микрограмм на миллилитр канамицин.
Инкубировать в 37 градусов centigrees встряхивания инкубатор при 120 об / мин в течение двух часов. Затем добавьте лактозу индуктора в окончательную концентрацию 0,5 миллимоля на литр и продолжайте трястись шесть часов, вызывая выражение EGFP. Эмпирически, при встряхивании шесть часов, OD600 может достигать 0,7 или выше.
Наконец, с помощью флуоресцентный микроскоп для проверки степени выражения EGFP. Добавьте 10 микролитров среды бактериальной культуры к слайду. Затем накройте крышкой скольжения.
Изучите экспрессию EGFP под флуоресцентный микроскоп. Добавьте 3,5 грамма тиогликолата в 100 миллилитров дистиллированной воды. Стерилизовать в автоклаве перед использованием.
Аспирировать тиогликоллатную среду в одномиллилитровый стерильный шприц в капюшоне. Одна мышь на шприц, чтобы избежать инфекции. Ввините один миллилитр 3,5%thioglycollate среды в брюшной полости мыши с помощью 23-го калибра иглы и поддерживать мышь с водой и пищевой ад libitum в течение трех дней.
Через три дня усыпляйте мышь путем вывиха шейки матки после быстрого индуцирования анестезии севофлюраном в закрытой коробке. Затем положите мышь в блюдо с 75%этанолом, чтобы стерилизовать и быстро перенести в капюшон. Поместите мышь на тарелку и прикрепите переднюю лапу на доске, чтобы зафиксировать положение мыши.
Используя пятими миллилитровый шприц с иглой 20-го калибра, ввимите пять миллилитров холодного PBS в нижнюю часть живота в брюшную полость мыши, избегая прокола кишечника. Выполните нежный массаж с двух сторон живота мыши. Затем аспирировать брюшной жидкости осторожно и медленно.
Выпределите брюшной жидкости в 50-миллилитровую центрифугу трубки. Повторите эти шаги два или три раза. Центрифуга подвесных клеток в течение 10 минут при 400 г в четыре-восемь по Цельсию.
Отбросьте супернатант и повторно посовекуйте клеточные гранулы в RPMI 1640 среды с 10%фетальной сывороткой крупного рогатого скота. Добавьте пять миллионов клеток в каждый колодец из шести-хорошо пластины для анализа цитометрии потока и 500 000 клеток на колодец в 24-хорошо пластины для флуоресцентного микроскопа. Культура клеток на 37 градусов centigrees в 5%carbon двуокиси инкубатора на ночь.
Культурная среда может быть обновлена через три часа, чтобы удалить неадъедерентные клетки, потому что большинство из них были лимфоциты. Наблюдайте за клетками под ярким полевым микроскопом, чтобы оценить жизнеспособность клеток и плотность клеток. Изображение, показанное здесь, было в нормальном состоянии первичной клетки.
Как правило, плотность макрофаговых клеток не была высокой, потому что большая часть перитонеаных клеток были лимфоциты. Удалите культурную среду с пластины из 24 колодец. Добавьте 100 микролитров свежей культуры среднего и 10 микролитров бактериальной среды.
Затем инкубировать пластину при 37 градусах градусов в 5%углеродного диоксида инкубатора в течение одного часа. Вымойте осторожно с 500 микролитер холодного PBS на хорошо три-пять раз, чтобы вымыть не интернализированных бактерий. Инкубировать клетки с 4%формальдегида в PBS при комнатной температуре в течение 30 минут.
Вымойте клетки с PBS три раза. Добавьте фаллоидин 633 конъюгированный рабочий раствор, чтобы окрашивать F-актин. Хранить в темном, влажном месте при комнатной температуре в течение 60 минут.
Добавьте рабочий раствор DAPI, чтобы окрашивать ядерную клетку и инкубировать в течение пяти минут в темном месте при комнатной температуре. Промыть один раз с PBS и один раз с тем же объемом в дистиллированной воде. EGFP-выражение E.coli отображается в зеленом служил маркером фагоцитоза.
Чтобы свести к минимуму экспериментальные ошибки и сделать надлежащую интерпретацию результатов, установите группы и контрольные трубки для эксперимента, перечисленные в таблице 2. Для контрольной группы, которая будет размещена на льду, удалить среду из шести хорошо пластины и мыть с PBS один раз. Затем добавьте 70 миллимол на литр холодного ЭДТА на миллилитр в колодец, чтобы отсоединить клетки и перенести в поток цитометрии трубки.
Добавьте 50 микролитров бактериальной суспензии в трубку и поместите его на лед в течение одного часа. Для других групп, удалить культуру среды, добавить один миллилитр свежей среде в каждом хорошо. Добавьте 50 микролитров суспензии бактерий в скважины в соответствии с группой настройки, как описано в таблице 2.
Затем поместите шести-хорошо пластины в 37 градусов centigrees 5%carbon диоксида инкубатора в течение одного часа. Чтобы утолить флуоресценцию не интернализированной E.coli, добавьте 200 микролитров 0,8%кристаллического фиолетового раствора воды в колодец и покачивайся в ближайшее время. Этот шаг был направлен на то, чтобы избежать ложноположительного результата путем привязки EGFP E.coli к поверхности макрофагов, но не интернализированной.
Вымойте клетки с PBS три раза, чтобы удалить остатки кристалл фиолетовый. Затем добавьте 70 миллимол на литр холодного ЭДТА на миллилитр в колодец, чтобы отсоединить клетки и перенести в поток цитометрии трубки. Центрифуга труб 2000 об / мин пять минут и отказаться от супернатанта.
Добавьте 100 микролитров PBS для повторного перерасхода клеток. Добавьте пять микролитров конъюгированных антител F4 ATP в трубки или изотип в соответствии с настройками группы. Vortex кратко и инкубировать образцы на льду в течение пяти до 10 минут в темноте.
Добавьте один миллилитр PBS в каждую трубку и центрифугу 2000 об/мин пять минут. Откажитесь от супернатанта. Повторное распределение клеточных гранул с 200 до 300 микролитров PBS для анализа цитометрии потока.
Запустите каждую трубку и получить данные, по крайней мере 10000 событий F4/80-положительных клеток. Вот флуоресценции изображения перитонеального макрофагов из молодых и возрастных групп. Красная флуоресценция представляет F-актин.
Зеленый цвет представляет EGFP-экспрессинг E.coli, а синий представляет ядро, окрашенное DAPI. Эти изображения показывают, что макрофаги от молодой мыши имели более сильную фагоцитаную способность, чем у пожилой мыши. F4/80-положительные и EGFP-положительные клетки указали фагоцитическую способность макрофагов.
Эти результаты согласуются с тенденцией результатов флуоресценции микроскопа. Ну, вы видите, хотя количество врожденных иммунных клеток может сохраняться в возрасте мыши, фагоцитатические способности значительно снизились по сравнению с молодой мышью. Многие методы были использованы для оценки макрофаг фагоцитоза.
Здесь мы демонстрируем усовершенствованные методы, которые удобны, быстры и экономически осуществимы. С EGFP-экспрессирования E.coli, фагоцитоз анализ может быть легко выполнена и измерена как поток цитометра и флуоресцентного микроскопа в соответствии с предпочитает исследователь. Также этот метод непосредственно измеряет фагоцитическую способность.
Результаты более воспроизводимы, чем другие косвенные методы.
