Shalom.The BW Репортер система позволяет изучать рецептор-лиганд взаимодействий. Это чрезвычайно полезно в тех случаях, когда лиганд конкретного рецептора неизвестен или в тех случаях, когда эксперименты с эндогенным лигандом технически сложны. Этот метод чувствителен и специфичен для индивидуального рецептора, прост в эксплуатации и воспроизводится.
Демонстрацией процедуры будет Шира Кахлон, постдок для моей лаборатории. За день до трансфекции, пластины 10 пластин с 10 миллилитров 100000 BW5147 клеток, и дополнить RPMI. Затем поместите 100 микрограммов плазмиды PCDNA3 в трубку.
Добавьте ацетат натрия при рН 5,3 в трубку. После этого добавьте 2,5 тома 100%этанола в плазмидную смесь. Затем инкубировать плазмидную смесь на ночь при температуре минус 20 градусов по Цельсию.
Через 24 часа после покрытия клеток BW, собирать клетки в двух 50 миллилитров труб. Затем центрифуга клетки на 515 г в течение пяти минут, и отказаться от супернатанта. Resuspend пелотон RPMI без дополнений и повторить центрифугации.
Resuspend в результате гранулы в 1 миллилитр RPMI без дополнений. Перенесите перерасходную гранулу на 4-сантиметровый кювет на льду. Центрифуга плазмида, которая прошла этанол осадков.
Затем промойте плазмид одним миллилитром 70%этанола. И повторите центрифугу еще на 20 минут. Удалите весь этанол и дайте грануле частично высохнуть.
Затем повторно посовещенные гранулы в 100 микролитров разогретой RPMI, без дополнений. После этого добавьте хлюпенированную плазмиду в клетки в кювете. Инкубировать клетки на льду в течение пяти минут.
Далее, электропорат клеток. Затем перенесите электропомерные клетки в 50-миллилитровую трубку. Добавить 50 миллилитров полной среды в трубку и центрифугу в течение пяти минут, при 515 г.
Отбросьте супернатант и повторно посовелите клетки в 50 миллилитров полной среды. Затем пластины клеток в 24-хорошо культуры блюда, и инкубировать клетки в течение 48 часов. После этого добавьте один миллилитр полной среды, дополненный 10 миллиграммами на миллилитр G418 к каждому хорошо.
48 часов спустя, отбросить один миллилитр верхнего объема каждой хорошо. Затем добавьте один миллилитр полной среды, дополненный пятью миллиграммами на миллилитр G418 к каждому хорошо. Используйте 50 000 трансфицированных клеток BW с желаемыми целями в одном колодец из пластины из 96 колодец.
Инкубировать тарелку в течение 48 часов. Затем заморозить пластину при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Пальто пластины ELISA с анти-мышь IL-2 антитела.
Поместите 05 микрограммов антимышки Ил-2 в объеме 50 микролитров PBS в каждую колодец. Инкубировать покрытием пластины на ночь при четырех градусах по Цельсию. Используйте короткий инкубационный период при 37 градусах по Цельсию, чтобы разморозить замороженные клетки BW, которые ранее были инкубированы своими целями.
Затем центрифуга пластины, и передать 100 микролитров supernatant от каждого хорошо предварительно покрытием пластины ELISA. И инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов. После этого добавьте биотин против мыши Ил-2 в пластину ELISA.
Затем после инкубации и стирки добавьте к пластине спряженный стрептавидин HRP. После инкубации и мытья добавьте 100 микролитров субстратного раствора TMB к каждой пластине ELISA. Наконец прочитайте пластину ELISA на 650 нанометров.
В этом примере клетки CLL были предварительно инкубированы различными антителами против CD20. А затем совместно инкубируется с трансфицированными клетками BW, которые выражают рецепторы Fc CD16, прежде чем анализировать с ELISA. После анализа с ELISA результаты были количественно.
Уровни оптической плотности, были преобразованы в концентрации мыши IL-2, на основе стандартной кривой. В дополнительном эксперименте различные дозы антител против CD20 были предварительно инкубированы клетками ХЛЛ. А затем инкубируется с трансфицированными клетками BW.
Частица содержит четыре основные части. Клонирование, трансфекция клеток BW, активация и ELISA. Каждая из частей должна быть проверена независимо.
После этой процедуры, дополнительные эксперименты могут быть выполнены с клетками, которые выражают эндогенные рецепторы, такие как убийство кислот с нк-клеток для изучения взаимодействия с рецепторами НК-клеток. Мы использовали эту систему, чтобы обнаружить новые лиганды рецепторов НК-клеток. Например, гемагглютинин является лигандом NKp46, а PVL является лигандом TG.
