Этот протокол позволяет провести анализ трехмерной структуры очень большого человека на мышечную жировую ткань балетной микроскопии. Облегчение связи патологической дисфункции с жировой тканью структурных изменений. Этот процесс очистки очень прост, очень хорошо приспособлены для очистки человека на теплых мышей жировой ткани и использовать менее токсичных растворителей, таких как этанол или метил салицилат по сравнению с другими четкими протоколами.
Начните с погружения собранных мыши или человека белой жировой ткани, по крайней мере 10 миллилитров 4%power формальдегида в PBS в 15 миллилитров пластиковой трубки преимущественно под химическим капотом. Встряхните ткань на подвижной пластине при комнатной температуре в течение одного часа, прежде чем передать трубку в подвижной пластины при четырех градусах по Цельсию на ночь. На следующее утро промыть фиксированной белой жировой ткани в 10 миллилитров PBS в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы удалить все следы фиксации и передачи ткани в 15 миллилитров трубки, содержащей 10 миллилитров 0,3% глицина в PBS в течение одного часа инкубации при комнатной температуре на орбитальном шейкере на 100 оборотов в минуту.
Когда оставшиеся свободные группы альдегида были утоляются, погрузите ткань в 15 миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров 0,2%Triton X-100 в PBS в течение двух часов инкубации с встряхиванием при 37 градусах по Цельсию. В конце инкубации лечить ткани с 10 миллилитров 0,2%Triton X-100 и 20%DMSO с встряхивания при 37 градусов по Цельсию в одночасье. На следующее утро погрузить ткани в 15 миллилитров пластиковой трубки, содержащей 10 миллилитров 0,1%Tween 20, 0,1%Triton X-100, 0,1%deoxycholate и 20%DMSO в PBS, по крайней мере 24 часа инкубации при 37 градусов по Цельсию со тряской.
В конце инкубации, промыть ткани с 10 миллилитров 0,2%Triton X-100 в PBS на орбитальном шейкере при 100 оборотов в минуту в течение одного часа. Затем погружение в 15 миллилитров 0,2%Triton X-100, 10%DMSO и 3%BSA в PBS в течение 12 часов при 37 градусах цельсия при тряске. Для окрашивания белой жировой ткани.
Передача ткани в 300 микролитров 0,2%Triton X-100, 10%DMSO и 3%BSA в PBS, дополненная первичными антителами, представляющими интерес в микротрубке 1,5 миллилитров, защищает ее от света алюминиевой фольгой и поместить трубку в 50-миллилитровую трубку Falcon. Поместите трубку в орбитальный шейкер в течение двух дней инкубации при 37 градусах по Цельсию со тряской. В конце инкубации промыть ткани два раза в 10 миллилитров 0,2%Triton X-100, 10%DMSO и 3%BSA в PBS в течение пяти часов при 37 градусах по Цельсию с встряхивания и защиты от света.
После второго полоскания промыть ткань в 10 миллилитров свежих 0,2%Triton X-100, 10%DMSO и 3%BSA и PBS в течение 16 до 48 часов при 37 градусах Цельсия при встряхивании, затем перенесите ткань в 1,5 миллилитровую трубку, содержащую 300 микролитров 0,2%Triton X-100, 10%DMSO и 3%BSA в PBS, дополненную соответствующими вторичными антителами и защищают трубку от света с помощью алюминиевой фольги. После двухдневной инкубации при 37 градусах по Цельсию на шейкере, мыть ткани два раза в 10 миллилитров 0,2%Triton X-100, 10%DMSO и 3%BSA в PBS в течение пяти часов при 37 градусах по Цельсию с встряхивания защищены от света. После второй стирки, промыть ткани в трубку, содержащую 10 миллилитров свежих 0,2%Triton X-100, 10%DMSO и 3%BSA в PBS в течение 16 до 48 часов при 37 градусов по Цельсию со встряхивания и легкой защиты.
Затем два часа мыть в 10 миллилитров PBS только при 37 градусов по Цельсию с встряхивания и легкой защиты. Для очистки белых жировых тканей в конце промывки PBS погрузите ткань и 10 миллилитров восходящей серии концентрации этанола в течение двух часов инкубации на концентрацию при комнатной температуре с встряхиванием, защищенным от света, как указано. На следующее утро погрузите ткань в стеклянную бутылку 20 миллилитров с пластиковой крышкой, содержащей пять миллилитров метилсалицилата в дымовой капюшоне.
Белая жировая ткань все еще хорошо видна на данном этапе. Встряхните контейнер защитить его от света при комнатной температуре, по крайней мере два часа. Белая жировая ткань становится полностью пересаженной.
Для 3D конфокальных изображений окрашенных и очищенной белой жировой ткани монтируют металлическую камеру визуализации, оснащенную стеклянным дном и в дымовом капюшоне передают ткань в камеру. Заполните камеру свежим метилсалицилатом. Завершите монтаж камеры, добавив небольшой крышкой скольжения для стабилизации ткани и большой крышкой скольжения, чтобы закрыть камеру.
Поместите камеру на перевернутую стадию конфокального микроскопа для визуализации тканей при низком увеличении, чтобы создать несколько кубических сантиметров 3D-карт всего образца жировой ткани. После генерации 3D-карты используйте воздушную цель на большие расстояния 20X, которая обеспечивает хорошее соотношение между разрешением и глубиной для выбора нескольких областей для отбора проб тканей при более высоком увеличении. Для сегментации ячеек конвертировать 3D стеки в формат программного обеспечения, чтобы освободить пространство памяти.
Перед открытием сотового модуля программного обеспечения. Измените настройку обнаружения клеток на плазменное окрашивание мембраны и выберите флуоресцентный канал маркера, используемый для разграничения периферии клеток. Затем на настройка пороговых значений, обеспечить диапазон ожидаемых размеров ячейки и запустить сегментации.
Влияние очистки на человека и мыши белой жировой ткани можно наблюдать невооруженным глазом. Очистка также резко улучшает глубину изображения ткани, которая может быть приобретена. И облегчает целые ткани 3D-изображения и 3D-карты поколения из 4X Увеличение.
3D-картирование также позволяет получить выбор различных областей, представляющих интерес, при увеличении 20X на глубину до двух миллиметров. Специфическое окрашивание липидных капель и адипоцитов может быть достигнуто с помощью перилипина и анти-GLUT4 антител соответственно. Кровеносные сосуды могут быть обнаружены с помощью антитела CD31 или внутривенной инъекции Lectin DyLight 649 незадолго до жертвоприношения.
Макрофаги и Т-клетки могут быть визуализированы с помощью анти CD301 фикоэритрона антитела и анти TCR бета Тихоокеанского синего антитела. Периферическая нервная сеть может быть обнаружена с помощью антитирозин гидроксилазы антитела. С помощью этих маркировки можно определить средний размер и размер распределения адипоцитов и плотность сети кровеносных сосудов в жировой ткани.
Очень важно следить за временем занятий, как это было продемонстрировано, потому что плохая подготовка образца не приведет к хорошему качеству изображения. Этот протокол можно комбинировать с передовой системой визуализации или может быть соединен с бесплатным анализом изображений после обработки изображений.
