Этот метод имеет потенциал для повышения дифференциации нервных стволовых клеток в пробирке и внести свой вклад в лечение неврологических заболеваний, таких как болезнь Паркинсона. Основными преимуществами этой методики является то, что холодная атмосферная плазма может быть применена в один шаг для безопасной направленной дифференциации нервных стволовых клеток для трансплантации тканей. Холодная атмосферная плазма может повысить дифференциацию нервных стволовых клеток в течение короткого периода лечения.
И с необходимостью большего повреждения клеток, обеспечивая желаемые клетки для трансплантации. Начните с посева около пяти раз десять до пятого murine нервных стволовых клеток в 25 сантиметров квадратной колбы. Содержит пять миллилитров полного DMEM в течение двух-трех дней при 37 градусах по Цельсию и пяти процентах углекислого газа.
Когда клетки достигают 85 процентов слияния, мыть культуру с одним миллилитров PBS. Перед лечением, с одним миллилитром 25 процентов трипсина в течение одной минуты. Когда клетки отсоединились, остановите реакцию одним миллилитром среды культуры.
И пипетка несколько раз для создания одной клеточной подвески. После подсчета, разбавить клетки в два раза десять до четвертой клетки на миллилитр концентрации. Семя один миллилитр стволовых клеток на один поли-D-лизин покрытием покрытия скольжения на скважину в девяти скважинах 12 пластины клеточной культуры.
Проверьте плотность клеток под микроскопом. И вернуть клетки в инкубатор на 12 часов. Когда клетки прикрепили, мыть крышку скользит два раза с одним миллилитром PBS на стирку, и лечить клетки с дифференциацией среды в течение 48 часов.
Для приобретения струи сначала подключите выходной провод питания к плазменовому реактивному устройству. И кончик высоковольтного зонда с выходной проволокой для обнаружения напряжения. Затем подключите другой конец высоковольтного зонда к осциллоскопу, чтобы зафиксировать информацию от выходного напряжения.
Проверьте всю схему, чтобы убедиться, что источник питания, осциллоскоп и высоковольтный зонд все заземлены. И проверьте газовую линию, чтобы убедиться, что газовая трубка подключена к плазменному реактивному устройству. Затем откройте гелий и кислородные газовые клапаны и установите поток газа на один литр до 01 литра в минуту соотношение гелия к кислороду.
Проверьте схему снова и нажмите кнопку вывода для создания плазменной струи. Для плазмы лечения нервных стволовых клеток установите расстояние между соплом шприца и первым колодецом клеток до 15 миллиметров. Замените супернатанты в культурах нервных стволовых клеток 800 микролитров свежей дифференциации среды.
И поместите пластину под плазменные струи. Убедившись, что сопло шприца фиксируется над центром каждой хорошо. Создайте три скважины с плазмой в течение 60 секунд за обработку и три скважины с одним процентом гелия и кислородного газа в течение 60 секунд за обработку.
Оставляя три колодца необработанными, как контроль. Затем замените супернатанты на один миллилитр свежей дифференциации среды. И вернуть клетки в инкубатор на шесть дней.
Проверьте статус дифференциации различных групп ежедневно, под перевернутым фазово-контрастным световым микроскопом. После лечения, дайте клеткам полностью эквилибрировать в состоянии среды в течение примерно одного часа, прежде чем заменить супернатант со свежей дифференциации среды. Для иммунофлуоресценции анализа, исправить культур с 500 микролитров четыре процента параформальдегида на колодец в течение 20 минут при комнатной температуре.
Затем три нежные пять минут полоскания, с одним миллилитров PBS за стирку. Далее, permeabilize фиксированных образцов с 2 процентов Triton X-100 в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем нежное полоскания, как попродемонстрировано.
После последней стирки, блокировать любые неспецифические связывания с одним миллилитр 10 процентов козьей сыворотки в PBS на образец в течение одного часа при комнатной температуре. В конце инкубации, этикетки клеток в каждом хорошо с 300 микролитров первичного антитела интерес ночь на четыре градуса по Цельсию. Затем три моет в PBS, как попродемонстрировано.
После последнего мытья, этикетка клеток с 300 микролитров соответствующих вторичных антител. Инкубировать в течение двух часов при комнатной температуре, защищенной от света. Затем аккуратно промойте клетки одним миллилитром PBS на колодец в течение десяти минут при комнатной температуре.
Изображение клеток на флуоресцентном микроскопе, оснащенном соответствующими фильтрами. Плазма обработанных нервных стволовых клеток демонстрируют ускоренную скорость дифференциации, и более высокий коэффициент дифференциации по сравнению с необработанным контролем, и газовый поток обработанных стволовых клеток. После плазменной обработки Нестин уменьшается.
Бета-Тубулин III значительно увеличивается. И O4 немного увеличивается, по сравнению с контролем обработанных и газовый поток обработанных стволовых клеток. Кроме того, после 60 секунд лечения плазмы наблюдается надежное выражение зрелых нейронов, холинергических нейронов и маркеров моторных нейронов.
С очень мало ГАМК и серотонергических нейронов, и не дофаминергических нейронов обнаружены. При попытке этих процедур, важно помнить, лечить клетки с надлежащей дозировкой плазмы, потому что длительный и интенсивный период лечения плазмы вызовет апоптоз клеток или некроз. Не забудьте также предварительно проверить жизнеспособность ячейки перед применением вниз по течению.
