Дисфункция локуса coeruleus был вовлечен в неврологических и нейропсихиатрических расстройств, в том числе болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, депрессия, биполярное расстройство, и тревога. Учитывая эти роли, анализ локуса coeruleus имеет решающее значение для изучения его функции и дисфункции. Во время секционирования мозга мыши, локус coeruleus можно легко пропустить в корональных или sagittal разделов из-за его небольшого размера.
Таким образом, чтобы предложить руководство по локализации локуса coeruleus, мы описываем протокол, который мы разработали, чтобы найти этот регион в мозге мыши для нескольких приложений. Начните с размещения свежеисполниженного мозга обезболивающей, а затем пропитанной мыши в 4%PFA в 50-миллилитровой трубке. Инкубировать мозг в течение 24 часов при четырех градусах по Цельсию.
Используйте типсы для переноса мозга в 50-миллилитровую коническую трубку, наполненную 25 миллилитров 30% раствора сахарозы. Инкубировать его при четырех градусах по Цельсию в течение 48 до 72 часов, пока мозг опускается на дно трубки. Чтобы встроить секцию ствола мозга, поместите ее вырезанную поверхность на дно встраиваемой формы и добавьте оптимальное соединение температуры резки, чтобы окружить ствол мозга.
Заморозить встроенный мозг в морозильной камере минус 80 градусов по Цельсию, по крайней мере 12 часов до дальнейшего использования. Поместите плесень с мозгом в криостат и инкубировать его в течение нескольких часов, чтобы приспособить его температуру к криостату. Чтобы разоблачить блок OCT, содержащий мозг, используйте лезвие бритвы, чтобы сократить четыре края формы в нижней части, а затем очистить от встраивания формы от него.
Используйте лезвия бритвы, чтобы удалить избыток OCT с поверхности блока, убедившись, что не прикасаться к мозгу. Затем смонтировать блок OCT на патрон криостата, подвергая вырезать поверхность мозга к передней. Чтобы настроить мозг, сориентировать поверхность разреза параллельно лезвиям бритвы криостата.
Правильное ориентация образца является важным шагом в этом протоколе. Поскольку мы используем анатомические особенности спинной поверхности мозга, чтобы найти LC, такие как граница между мозжечок и нижний колликул, важно, чтобы разделы были выровнены должным образом. Это требует ухода в правильной настройке мозга в матрицу срез мозга мыши.
Обрезать мозг, начиная с medulla, резки 100-микрометровых секций rostrally. Как только мозжечок и ствол мозга начинают резать как один непрерывный ломтик на уровне четвертого желудочка, начните собирать ломтики толщиной 50 микрометров. Используйте типсы, чтобы собрать каждый кусочек мозга и поместить его в колодец 24-хорошо пластины заполнены PBS.
Локус coeruleus будет наиболее заметным в ломтик, где мозжечок и нижний колликул встречаются друг с другом около 5,52 миллиметра задней брегмы. В первый день, мыть ломтики мозга в 24-хорошо пластины три раза в течение пяти минут каждый в PBS. Затем добавьте 0,5%PBS с моющим средством и пронизывают их при четырех градусах цельсия в течение 24 часов.
На следующий день, мыть ломтики три раза в течение пяти минут каждый с 0,5%PBSD. Затем добавьте первичное антитело при разбавлении от одного до 500 в 0,5%PBSD и инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение 18 часов. На третий день, мыть ломтики три раза в течение 10 минут каждый с 0,5%PBSD, а затем добавить вторичное антитело при разбавлении от одного до 1000 в 0,5%PBSD.
Оберните пластину алюминиевой фольгой и инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение 16 часов. После инкубации, мыть ломтики три раза в течение пяти минут каждый с 0,5%PBSD, а затем в течение пяти минут в PBS. Обложка разделов с использованием жесткого набора монтажа среды без DAPI.
Накрыть стеклянной крышкой и высушить в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем используйте конфокальный микроскоп с настройками для обнаружения сигнала от соответствующей длины волны флуоресценции до ломтиков мозга изображения. После настройки микроскопа к фокусной плоскости мозга ломтик, использовать 10 раз увеличение принять одно изображение.
Используйте четвертый желудочек, расположенный ниже мозжечка и выше понс и ствол мозга, чтобы найти возможную область LC в срезе мозга. Сосредоточьтесь на боковой кромки четвертого желудочка и LC будет расположен, начиная с краев четвертого желудочка и указывая на область ствола мозга понс. Внутриклеточное распределение бета-гидроксилазы допамина, белка, выраженного в LC, было оценено с помощью этого протокола для изучения морфологии LC и плотности нейронов.
Другой белок, выраженный в LC, гидроксилаза тирозина, также показал сильный зеленый флуоресцентный сигнал в ломтиках мозга, содержащих LC.Изменения в металлическом гомеостазе часто наблюдаются при неврологических расстройствах, включая изменения в LC.In этот пример, когда ломтик мозга, прорезанный через LC, измерялся для фосфата, калия, цинка и меди, только медь показала определенное увеличение сигнала. Мы рекомендуем резки около 500 микрон больше ткани передней и задней LC, чтобы избежать пропуска ядра, и резки больше разделов, чем это необходимо, особенно если в первый раз выполнения этого протокола. Тщательное изучение изображений атласа мозга до окрашивания очень полезно.
После того, как LC расположен иммуногистохимии, соседние ломтики мозга могут быть использованы для дальнейших исследований, в том числе морфологического и метаболического анализа, а также исследования металлоискателя с помощью рентгеновской микроскопии флуоресценции. Секции мозга, генерируемые с помощью описанного протокола, могут быть использованы для количественной оценки уровней меди и других металлов в LC и сравнения их с уровнями в регионах за пределами LC, что необходимо для понимания механизма заболевания. Дальнейшее возможное применение этого протокола включают обнаружение изобилия и внутриклеточного распределения бета-гидроксилазы допамина, гидроксилазы тирозина и других белков, выраженных в LC индивидуально, или в совместно окрашивающих анализах, исследованиях морфологии LC и плотности нейронов.
