Этот метод может помочь в предварительном отборе клонов хромосом штаммами Pichia pastoris, выражают рекомбинантные белки в условиях де-репрессированных простыми культивированиями колбы встряхивания до масштабирования. Основным преимуществом этого метода является то, что высокий уровень метанола свободного выражения белка может быть достигнуто с помощью Pichia pastoris, который поддерживается точный онлайн мониторинг важных параметров культивирования. Как правило, лица, новые для этого метода может бороться, потому что точка времени для начала стекла растут корма должна быть адаптирована к характеристикам роста конкретного штамма производства.
Прежде чем создать основную культуру, семя одной свежей колонии экспрессии штамма интереса в 5 мл дрожжевого пепто и бульона декстрозы в 50 мл конической трубки. Оставьте крышку слегка открытой, чтобы обеспечить надлежащее аэрации. Чем, поместите культуру в шейкер при 28 градусов по Цельсию, 80% влажности и от 100 до 130 об /мин ночь.
На следующее утро запустите программное обеспечение для подключения устройств через Bluetooth. Затем нажмите серебряную кнопку на передней части измерительного устройства биомассы, чтобы включить bluetooth-соединение с устройством и нажмите кнопку найти устройства в программном обеспечении мониторинга компьютера. Перетащите и опустите найденные устройства на квадраты в лотке измерения и нажмите кнопку подключения.
При успешном подключении появится экран управления. Чтобы настроить эксперимент, нажмите кнопку «Начать измерение». Назовите эксперимент и проверьте, включены ли все параметры, необходимые для мониторинга.
Установите интервал до трех минут, а средние точки измерения до 11. Введите имена для образцов и пропустите калибровку угла. Измерьте плотность клеток ночной культуры, разбавленной соотношением один-двадцать в среде культивирования в спектрофотометре на длине волны 600 нанометров.
Прививка 50 мл среды с ночной культуры до OD 600 из 05. Кроме того, поместите колбы в детекторах при 28 градусах по Цельсию, 130 об/мин и 80% влажности в течение пяти минут. Нажмите кнопку начать измерение в программном обеспечении.
Через четыре часа после прививки используйте образец 2 мл для измерения плотности клеток, как это было продемонстрировано. Когда концентрация кислорода приближается к нулю и клетки находятся на экспоненциальной фазе роста добавить четыре глицерола корма дисков для каждой колбы в стерильных условиях. Чем, вернуть колбы в трясусь инкубатор в течение дополнительных 60 до 90 часов.
Возьмите образцы каждые 24 часа, чтобы контролировать плотность клеток и экспрессию белка по анализу выбора. В конце культивирования перенесите культуры в 50 мл конических трубок для центрифугации. Экспорт данных онлайн-измерений в качестве файла электронной таблицы из программного обеспечения для дальнейшего анализа.
В этом репрезентативном культивировании начальная концентрация глицерола составила 5%, хотя кормовые диски были добавлены, когда биомасса увеличивается в геометрической прогрессии, кислород снизился почти до нуля. Более низкие концентрации глицерола уменьшили влияние краткосрочных ограничений кислорода и поэтому рекомендуются для де-репрессированного экспрессии белка. В этом репрезентативном эксперименте, в котором гормон роста человека был выражен под контролем источника углерода репрессированных промоутер при истощении глицерола выражение белка путем де-репрессии было обеспечено добавлением четырех дисков корма на колбу.
Как и ожидалось, экспрессия гормона роста человека и развитие биомассы увеличились с течением времени в присутствии дисков глицерола корма, в то время как экспрессия белка уменьшилась с течением времени и биомасса оставалась постоянной при отсутствии глицерола дополнения. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы тщательно наблюдать параметры выращивания, чтобы определить оптимальное время начала выражения. После этой процедуры другие методы, такие как определение концентрации белка западного анализа помарки или анализа активности могут быть выполнены для оценки урожайности белка, а также мелкомасштабных экспериментов биореактора, чтобы ответить на дополнительные вопросы о производительности индивидуальной нагрузки в более широком масштабе.
После его развития, этот метод проложил путь для исследователей в области метанола свободного рекомбинантного выражения белка, чтобы исследовать перспективную альтернативу широко используемому метанолу зависимого промоутера AOX1 на Pichia pastoris.
