Diese Methode kann bei der Vorauswahl von Chromosomen-Klonen durch Pichia pastoris-Stämme helfen, die rekombinante Proteine unter de-unterdrückten Bedingungen durch einen einfachen Schüttelkolbenanbau vor der Skalierung exemitzenieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass mit Pichia pastoris eine hochgradig methanolfreie Proteinexpression erreicht werden kann, die durch die genaue Online-Überwachung wichtiger Anbauparameter unterstützt wird. Im Allgemeinen können Personen, die neu bei dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, weil der Zeitpunkt für den Beginn des Glasanbaufutters an die Wachstumsmerkmale der spezifischen Produktionssorte angepasst werden muss.
Vor dem Aufbau der Hauptkultur, säen Sie eine einzige frische Kolonie des Ausdrucks Stamm von Interesse in 5 ml Hefe-Pepto und Dextrose-Brühe in einem 50 ml konischen Röhrchen. Lassen Sie den Deckel leicht offen, um eine ordnungsgemäße Belüftung zu ermöglichen. Dann, stellen Sie die Kultur in einem Shaker bei 28 Grad Celsius, 80% Luftfeuchtigkeit und 100 bis 130 RPM über Nacht.
Am nächsten Morgen starten Sie die Software zum Verbinden der Geräte über Bluetooth. Drücken Sie anschließend die silberne Taste auf der Vorderseite des Biomassemessgeräts, um die Bluetooth-Verbindung zum Gerät einzuschalten, und klicken Sie in der Computerüberwachungssoftware auf Geräte suchen. Ziehen Sie die gefundenen Geräte auf die Quadrate im Messfach und klicken Sie auf Verbinden.
Wenn eine erfolgreiche Verbindung hergestellt wird, wird ein Steuerbildschirm angezeigt. Um ein Experiment einzurichten, klicken Sie auf Messung starten. Benennen Sie das Experiment, und überprüfen Sie, ob alle für die Überwachung erforderlichen Parameter aktiviert sind.
Legen Sie das Intervall auf drei Minuten fest, und die durchschnittlichen Messpunkte werden auf 11 Minuten festgelegt. Geben Sie die Namen für die Proben ein, und überspringen Sie die Winkelkalibrierung. Messen Sie die Zelldichte der Nachtkultur, die im Verhältnis eins bis zwanzig im Kultivierungsmedium in einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern verdünnt wird.
50 ml des Mediums mit der Nachtkultur auf eine OD 600 von 05 impfen. Dann legen Sie die Kolben in den Detektoren bei 28 Grad Celsius, 130 U/min und 80% Luftfeuchtigkeit für fünf Minuten. Klicken Sie in der Software auf Messung starten.
Verwenden Sie vier Stunden nach der Impfung eine 2 ml-Probe für die Messung der Zelldichte, wie gerade gezeigt. Wenn sich die Sauerstoffkonzentration dem Nullpunkt nähert und sich die Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase befinden, fügen Sie jedem Kolben unter sterilen Bedingungen vier Glycerin-Futterscheiben hinzu. Dann geben Sie die Kolben für weitere 60 bis 90 Stunden an den Schüttelinkubator zurück.
Nehmen Sie alle 24 Stunden Proben, um die Zelldichte und die Proteinexpression durch den Assay ihrer Wahl zu überwachen. Am Ende des Anbaus die Kulturen zur Zentrifugation in 50 ml konische Röhrchen übertragen. Exportieren Sie die Online-Messdaten als Tabellenkalkulationsdatei aus der Software zur weiteren Analyse.
In diesem repräsentativen Anbau betrug die Anfangskonzentration von Glyzerin 5%Obwohl die Futterscheiben hinzugefügt wurden, als die Biomasse exponentiell zunahm, verringerte sich der Sauerstoff auf nahezu Null. Niedrigere Glyzerinkonzentrationen reduzierten die Wirkung der kurzfristigen Sauerstoffbeschränkungen und werden daher für die de-unterdrückte Proteinexpression empfohlen. In diesem repräsentativen Experiment, bei dem das menschliche Wachstumshormon unter der Kontrolle eines Kohlenstoffquellen-verdrängten Promotors bei Glyzerinabbau exprimiert wurde, wurde die Proteinexpression durch Derepression durch die Zugabe von vier Futterscheiben pro Kolben sichergestellt.
Wie erwartet nahmen die menschliche Wachstumshormonexpression und die Biomasseentwicklung im Laufe der Zeit in Gegenwart der Glycerin-Feed-Scheiben zu, während die Proteinexpression im Laufe der Zeit abnahm und die Biomasse ohne die Glycerin-Ergänzung konstant blieb. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Kultivierungsparameter sorgfältig zu beachten, um eine optimale Startzeit des Ausdrucks zu bestimmen. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Proteinkonzentrationsbestimmung Western Blot Analysis oder Aktivitätstests für die Proteinausbeuteauswertung sowie kleine Bioreaktorexperimente durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Leistung des einzelnen Stammes in größerem Maßstab zu beantworten.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der methanolfreien rekombinanten Proteinexpression, um eine vielversprechende Alternative zum häufig verwendeten Methanol-abhängigen AOX1-Promoter auf Pichia pastoris zu erforschen.
