Метод, который мы разработали здесь, оказался чрезвычайно полезным в нашей работе, пытаясь выяснить молекулярные механизмы секреции гормонов из кишечника, но и поглощение питательных веществ, и связь между ними. Основным преимуществом этой высоко физиологической техники является то, что кишечник остается на месте, позволяя при этом подробные исследования, которые обычно выполняются только в моделях In Vitro. Первое место крысы на подогревом операционного стола, подтвердить отсутствие реакции на щипать, и сделать кожу и перитонеальной иссечения подвергать брюшной полости.
Перемести тонкий кишечник в сторону, чтобы разоблачить терминальной области толстой кишки. И ligate поставки сосудов в толстой кишке. Постепенно извлекайте толстую кишку, начиная с терминальной области, и двигаясь к тонкой кишке, увлажняя ткань изотоническим солевым раствором, и используя ватные тампоны для удаления соединительной ткани по мере необходимости.
Когда все толстой кишки были удалены, вставьте 15-сантиметровый кусок пластиковой трубки в проксимальный конец небольшой кишечный люмен, и обеспечить трубки с швами. Затем используйте 10-миллилитровый шприц и шприц-насос, чтобы тщательно промыть тонкий кишечник с изотоническим солевым раствором комнатной температуры на 25-миллилитр в минуту скорости потока. Когда ткань была очищена от чима, настроить ткани так, что верхняя мезентерная артерия доступна и удалить соединительной ткани и жировой ткани подвергать артерии.
Используйте тонкие точечные миппы, чтобы поместить два шва под мезентерную артерию и два шва под вену портала. Заполните пластиковый 22-калибровочный катетер, прикрепленный к подвижному насосу с перфузией буфера и использовать пару хирургических ножниц, чтобы сократить небольшое отверстие в мезентерической артерии, сразу же вставив катетер в разрез. Вставьте катетер в течение двух минут после резки отверстие в артерии, в противном случае кишечник, скорее всего, страдают от ишемической повреждения.
Как только катетер был закреплен швом, запустите подвижной насос, чтобы инициировать перфузию на 7,5 миллилитров в минуту скорости потока. Когда кровеносные сосуды в кишечнике и портвейной вене бледнеют, вырежьте отверстие в вене портала. Вставьте металлический катетер, и обеспечить металлический катетер с другой шов.
Позаботьтесь при вставке катетера в портвейную вену, так как вена тонкая стенка. Однако, как охранник в настоящее время perfused, быстрая вставка не имеет решающего значение. После сбора вывода перфузии в течение одной минуты, измерить громкость и нажмите выполнить эксперимент в программе записи давления, чтобы инициировать перфузии давления приобретения записей.
Затем накройте кишечник увлажненной лабораторной тканью, чтобы он не высыхал, и подтвердите, что дистальный конец кишечника не блокируется, и светимая гаплоида может выйти. Для измерения частичного давления кислорода и двуокиси углерода, собирать перфузии буфера через трехмерный стоп-кран клапан непосредственно перед его входит в орган, примерно через три минуты перфузии, и от катетера вставляется в портальный вены. Поместите образцы на лед, и использовать автоматизированный анализатор газа крови для измерения образцов вскоре после сбора.
Используйте сборщик фракций для получения первых базовых образцов. После 10 до 15 минут базового сбора, использовать шприц насос для администрирования первого внутрисупертиального тест стимулятора через три пути стоп-кран на 35 миллилитров в минуту скорость потока. Выполните светимую стимуляцию путем первоначальной инъекции удавов стимуляции, доставленной на 2,5 миллилитра в минуту скорости потока в течение первых пяти минут стимуляции, а затем введение тестового раствора на 5 миллилитров в минуту скорости потока.
Как только период светимой стимуляции закончится, промыть люмен с изотоническим солевым раствором на 2,5 миллилитра в минуту скорость потока в течение пяти минут. Затем собирайте базовые образцы по 5 миллилитров в минуту в течение 15-30 минут до введения следующего испытательного вещества. В конце эксперимента, управлять подходящим, положительный контроль для проверки на отзывчивость препарата в течение пяти-десяти минут, сбор и дополнительные от 10 до 15 минут базовых образцов в конце периода положительного контроля стимуляции.
Здесь показан пример данных хорошего качества, демонстрирующих глюкагон-как пептид-1 или GLP-1, секрецию из изолированного пролитого тонкого кишечника крысы, собранную с интервалом в одну минуту. В базальных условиях, секреция была устойчивой в то время как до и после введения стимула теста и положительный контроль, надежный секреторный ответ был очевиден. Эти данные секреции GLP-1, полученные из изолированной пронизанной крысиной тонкой кишки, имеют низкое качество с неустойчивой секрецией, измеряемой в базальных условиях, которые дрейфовали вверх на протяжении всего испытания таким образом, что, как представляется, не связаны с администрациями испытательных веществ или с положительным контролем.
Поэтому невозможно сделать вывод о том, была ли повышенная секреция GLP-1, наблюдаемая в конце стимуляции сосудистой фруктозы, опосредовавой реакцией. При попытке этой процедуры, чтобы заботиться, чтобы обеспечить катетеры должным образом и тщательно очистить перфузионное оборудование, как перфузии буфер обеспечивает отличную среду для роста бактерий. Следуя этой процедуре, другие методы, такие как In Vitro исследования гормон-секретирования клеточных линий первичных культур кишечных клеток, могут быть выполнены непосредственно исследовать внутриклеточное производство циклического АМП или внутриклеточного кальция.
Таким образом, мы уже использовали метод для выяснения ряда процессов, связанных с поглощением питательных веществ и механизмом секреции гормонов, и он оказался чрезвычайно полезным. Не забывайте, что работа с блокаторами или активаторами молекулярных сайтов может быть чрезвычайно опасным и меры предосторожности, такие как использование лабораторного пальто, перчаток и защитных очков, дым капот всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
