الطريقة التي طورناها هنا قد تبين أنها مفيدة للغاية في عملنا ، في محاولة لمعرفة الآليات الجزيئية لإفراز الهرمونات من الأمعاء ، ولكن أيضًا امتصاص العناصر الغذائية ، والاقتران بين الاثنين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية الفسيولوجية العالية هي أن الأمعاء تترك في الموقع ، مع السماح بإجراء دراسات مفصلة عادةً فقط داخل نماذج In Vitro. المقام الأول الفئران على طاولة عمليات ساخنة، تأكيد عدم وجود استجابة لقرصة إصبع قدم، وجعل استئصال الجلد والصواني لفضح تجويف البطن.
نقل الأمعاء الدقيقة إلى الجانب لفضح منطقة المحطة الطرفية من القولون. وligate الأوعية الدموية توريد إلى القولون. استخراج القولون تدريجيا، بدءا من منطقة المحطة الطرفية، والتحرك نحو الأمعاء الدقيقة، ترطيب الأنسجة مع المالحة متساوي التوتر، واستخدام مسحات القطن لإزالة النسيج الضام حسب الضرورة.
عندما تم إزالة كل من القولون، إدراج قطعة 15 سم من الأنابيب البلاستيكية في نهاية قريبة من تجويف الأمعاء الصغيرة، وتأمين الأنابيب مع الغرز. ثم استخدام حقنة 10 ملليلتر ومضخة حقنة لطرد بعناية الأمعاء الدقيقة مع درجة حرارة الغرفة المالحة متساوي التوتر بمعدل تدفق 25 ملليلتر في الدقيقة الواحدة. عندما يتم إفراغ الأنسجة من chyme، وضبط الأنسجة بحيث يمكن الوصول إلى الشريان الأوسط العلوي وإزالة النسيج الضام والأنسجة الدهنية لفضح الشريان.
استخدام ملقط نقطة غرامة لوضع اثنين من الغرز تحت الشريان المساريق واثنين من الغرز تحت الوريد المدخل. املأ قسطرة بلاستيكية من عيار 22 متصلة بمضخة متدحرجة مع عازلة للضخ واستخدم زوجًا من المقص الجراحي لقطع ثقب صغير في الشريان الميرينتاري ، وإدخال القسطرة على الفور في الشق. أدخل القسطرة في غضون دقيقتين من قطع ثقب في الشريان ، وإلا فإن القناة الهضمية ستعاني على الأرجح من تلف الإقفاري.
بمجرد أن يتم تأمين القسطرة مع خياطة، بدء مضخة المتداول لبدء ضخ بمعدل تدفق 7.5 ملليلتر في الدقيقة الواحدة. عندما تتحول الأوعية الدموية في الوريد المعوي والداخلي، تقطع ثقبًا في الوريد المدخلي. أدخل قسطرة معدنية، واضمن القسطرة المعدنية مع خياطة أخرى.
يجب الحرص عند إدخال القسطرة في الوريد المدخل، حيث أن الوريد رفيع الجدران. ومع ذلك ، كما يجري الآن حارس perfused ، إدراج سريع ليست حاسمة. بعد جمع الإخراج perfusion لمدة دقيقة واحدة، وقياس حجم وانقر فوق تنفيذ التجربة في برنامج تسجيل الضغط لبدء تسجيل اكتساب ضغط perfusion.
ثم تغطية القناة الهضمية مع أنسجة مختبر مبللة لمنعها من الجفاف، والتأكد من أن نهاية القاصي من الأمعاء ليست مسدودة، ويمكن الخروج من الهابلويد اللمبّر. لقياس الضغط الجزئي للأوكسجين وثاني أكسيد الكربون، وجمع عازلة الضخ من خلال صمام وقف الديك ثلاثية الاتجاه مباشرة قبل أن يدخل الجهاز، بعد ما يقرب من ثلاث دقائق من التسريب، ومن القسطرة إدراجها في الوريد المدخل. ضع العينات على الجليد، واستخدم محلل غاز الدم الآلي لقياس العينات بعد وقت قصير من جمعها.
استخدم جامع الكسر للحصول على عينات الأساس الأولى. بعد 10 إلى 15 دقيقة من جمع خط الأساس، استخدم مضخة حقنة لإدارة أول منبه اختبار داخل المفاصل من خلال وقف الديك ثلاثية في 35 ملليلتر في الدقيقة معدل التدفق. تنفيذ التحفيز اللمعان عن طريق حقن بواس التحفيز الأولي تسليمها بمعدل تدفق 2.5 ملليلتر في الدقيقة خلال الدقائق الخمس الأولى من التحفيز، تليها إدارة محلول الاختبار بمعدل تدفق 5 ملليلتر في الدقيقة.
بمجرد أن تنتهى فترة التحفيز اللمبينية، قم بتدفق التجويف بالملوحة ال isotonic بمعدل تدفق 2.5 ملليلتر في الدقيقة لمدة خمس دقائق. ثم جمع عينات خط الأساس في 5 ملليلتر في الدقيقة لمدة 15 إلى 30 دقيقة قبل أن تدار مادة الاختبار المقبل. في نهاية التجربة، وإدارة مناسبة، ومراقبة إيجابية لاختبار لمدى استجابة للتحضير لمدة خمس إلى عشر دقائق، وجمع إضافية 10 إلى 15 دقيقة من عينات خط الأساس في نهاية فترة التحفيز التحكم إيجابية.
هنا هو مبين مثالا على بيانات ذات نوعية جيدة، مما يدل على جلوكاغون مثل الببتيد-1 أو GLP-1، إفراز من الأمعاء الدقيقة الفئران perfused معزولة التي تم جمعها على فترات دقيقة واحدة. في ظل الظروف القاعدية ، كان إفراز ثابت في حين قبل وبعد إدارة التحفيز الاختباري والتحكم الإيجابي ، كان هناك استجابة سرية قوية واضحة. هذه البيانات إفراز GLP-1 التي تم الحصول عليها من الأمعاء الدقيقة الفئران المُعَدَّدة المعزولة ذات نوعية رديئة مع إفراز غير مُتَرَسَّس يُقاس في الظروف القاعدية التي انجرفت صعودًا طوال الاختبار بطريقة بدت غير ذات صلة بإدارات مواد الاختبار أو بالتحكم الإيجابي.
ولذلك فمن المستحيل أن نستنتج ما إذا كان زيادة إفراز GLP-1 لوحظ في نهاية تحفيز الفركتوز الوعائي كان استجابة بوساطة الفركتوز. أثناء محاولة هذا الإجراء لرعاية لتأمين القسطرة بشكل صحيح وتنظيف شامل لمعدات الضخ كما يوفر عازلة الضخ وسيلة ممتازة لنمو البكتيريا. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل دراسات في المختبر على خطوط الخلايا التي تفرز الهرمونات لثقافات الخلايا المعوية الأولية، للتحقيق مباشرة في إنتاج AMP دوري أو الكالسيوم داخل الخلايا داخل الخلايا.
لذلك لقد استخدمنا بالفعل الطريقة الآن لتوضيح عدد من العمليات وراء امتصاص المواد الغذائية وآلية إفراز الهرمونات واتضح أنها مفيدة للغاية. لا ننسى أن العمل مع حاصرات أو المنشطات من المواقع الجزيئية يمكن أن تكون خطرة للغاية والاحتياطات مثل استخدام معطف المختبر، والقفازات، ونظارات السلامة، وغطاء الدخان ينبغي دائما أن تؤخذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
