Этот метод позволяет изумить влияние различных механических схем погрузки, условий окружающей среды или стадий дегенерации хряща на уязвимость суставных хондроцитов in situ. Физические силы. В отличие от других методов, эти измерения выполняются в режиме реального времени и в полностью нетронутой хряща без ущерба для местных пограничных условий.
Еще одним преимуществом этого метода является использование модели мыши, позволяющей проверить, как специфические гены влияют на восприимчивость хондроцитов на месте при механических повреждениях. Для вскрытия дистальной бедренной кости поместите мышь в положение на спине и сделайте пятимиллиметровый разрез кожи на передней части колена. Расширяй разрез вокруг колена.
И ототяните кожу, чтобы разоблачить мышцы коленного сустава и ног. Начиная с проксимального конца бедренной кости, используйте лезвие скальпеля номер одиннадцать, чтобы разрезать вдоль кости в дистальной направлении. Позиционирование лезвия между четырехглавой мышцы сухожилия единицы и передней стороне бедренной вала.
Продлите разрез мимо пателлы. Резка через середину сухожилия patellar для удаления четырехглавой мышцы сухожилия единицы. Далее, начиная с проксимального конца бедренной кости, распорежьте лезвие скальпеля между блоком сухожилия мышцы подколенного сухожилия и задней стороной бедренной кости и разрежьте вдоль кости в дистальной направлении.
Когда разрез приближается к коленного сустава, прорезать мягкую ткань, и закончить разрез мимо коленного сустава. Потяните назад четырехглавые и подколенные мышцы, чтобы разоблачить бедренную кость. И отрезать любые избыточные мышцы на боковой и медиальной стороны кости.
Вырежьте икроножную мышцу на задней стороне проксимальной голени. И переверните ногу, чтобы визуализировать заднюю сторону бедренной кости. Удалите избыток ткани вокруг коленного сустава, чтобы разоблачить дистальные кондилы бедренной кости и задней поверхности проксимальной голени.
Отрежьте передние и задние крестообразные связки от бедренной кости. И вытащить голени от бедренной кости, разрезая все связки, чтобы отделить нижнюю ногу от бедренной кости. Используя стандартные ножницы для вскрытия, прорезать бедренную кость на проксимальной конце кости около восьми миллиметров над тибиофеморальным суставом с боковой стороны.
И использовать миппы ювелира, чтобы удалить окружающие мягкие ткани из бедренной кости. Затем разоблачить хрящ на обоих кондилях на дистальной конце бедренной кости. Периодически увлажняйте суставную поверхность с помощью HBSS.
Для вскрытия плечевой кости поместите мышь в положение лежа. И используйте микро ножницы, чтобы сделать пятимиллиметровый разрез на задней стороне локтя. Расширение разреза вокруг локтя и потянув назад кожи подвергать мышцы на руке и плече.
Начиная с проксимального конца плечевой кости, положение лезвие числа одиннадцать скальпель между трицепс мышцы сухожилия единицы и задней стороне плечевой кости. И вырезать вдоль кости в дистальной направлении. Расширьте разрез к дистальной части плечевой кости, через сухожилие трицепса и оттяните трицепс к проксимальной конце плечевой кости, пока плечевая головка подвергается.
Вырежьте соединительной ткани вокруг плечевой головой, не касаясь суставной поверхности. И удалить конечность из тела. Гидрат суставной поверхности плечевой головки с HBSS.
Чтобы отключить плечевой кости от руки, используйте типсы, чтобы разорвать проксимальный конец локтевой кости на задней стороне руки. И вырезать соединительной ткани вокруг дистального конца плечевой кости, удаление каких-либо избыточных тканей на кости. Затем используйте стандартные рассечение ножницами, чтобы удалить дельтовидную трубчатость на задней стороне плечевой кости.
И поместите расчлененный образец в 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку, содержащую HBSS. Для окрашивания образцов Calcein AM перенесите кости в микроцентрифугную трубку размером 1,5 миллилитра, содержащую 500 микролитров 10,05 микромолярного кальцеина в HBSS. И поместите трубку в термомешалку при 37 градусах По Цельсию при 800 об/мин, защищенной от света.
Через тридцать минут, мыть образец в свежем HBSS в течение десяти минут. И перенесите образец на стеклянную горку пользовательского микроскопа, установленного механическим испытательным устройством, таким образом, чтобы суставная поверхность задней бедренной кондилы или плечевой головой сидела на стекле. Гидратировать образец с ПОМОЩЬю HBSS и поместить устройство с образцом на стадии флуоресценции микроскопа.
Изображение суставных хондроцитов, окрашенных Calcein AM перед применением нагрузки под 4x увеличение. Отрегулируйте настройки приобретения для оптимизации качества изображения. Чтобы применить статическую механическую нагрузку, удерживайте предписанную статическую нагрузку поверх образца так, чтобы суставной хрящ сжимался против крышки стекла в течение пяти минут, прежде чем снять нагрузку.
Чтобы применить ударную механическую нагрузку, уроните цилиндрический ударник известного веса на образец с предписанной высоты, выпустив нагрузку через пять секунд после удара. Сразу же после того, как любая нагрузка была удалена, инкубировать образец в свежеприготовленных 60 микро-пропридий йодида в один миллилитр HBSS. В течение пяти минут при комнатной температуре, а затем повторное изображение суставных хондроцитов с помощью флуоресценции микроскопии, как только что продемонстрировали.
Для количественной оценки площади травмированных и мертвых клеток благодаря применяемому режиму механической нагрузки сначала откройте микрографы суставной поверхности, приобретенные до и после применения механической нагрузки в ImageJ. Объедините изображения в стек. Установите масштаб изображений на основе разрешения изображения.
Далее определите область, где клетки стали Calcein отрицательным и PI положительным. Эти клетки считаются ранеными или мертвыми. Затем определите область травмированных мертвых клеток с помощью измерительных приборов.
По крайней мере шесть испытанных применяются протоколы загрузки воспроизводимо индуцированных количественно локализованных областях травмы клеток в бедренных и плечевой хрящи, полученные от восьми до десяти недель старый клапан C мышей. Во всех проверенных протоколах погрузки более высокие величины нагрузки и более высокая интенсивность воздействия значительно усугубили спациальные масштабы травм клеток как у бедренной кости, так и у гумери. При выполнении вскрытий важно помнить, чтобы не связаться с суставным хрящом с хирургическими инструментами, так как это может поставить под угрозу базовый уровень по способности образцов.
Использование этой зеркальной модели может облегчить исследования остеоартрита, так как болезнь легко индуцируется у мышей с помощью генетических, диетических или хирургических манипуляций. Наша платформа также предоставляет инструмент для допроса фундаментальных научных вопросов и для скрининга терапевтических вмешательств, направленных на механическую уязвимость хондроцитов.
