Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen verschiedener mechanischer Belastungsschemas, Umweltbedingungen oder Stadien der Knorpeldegeneration auf die Anfälligkeit von in situ artikulären Chondrozyten. Die physischen Kräfte. Im Gegensatz zu anderen Techniken werden diese Messungen in Echtzeit und in vollständig intaktem Knorpel durchgeführt, ohne die einheimischen Randbedingungen zu beeinträchtigen.
Ein weiterer Vorteil dieser Technik ist, dass es ein Mausmodell verwendet, das es ermöglicht, zu testen, wie bestimmte Gene die Anfälligkeit von In-situ-Chondrozyten bei mechanischen Verletzungen beeinflussen. Zur Zerlegung des distalen Oberschenkelknochens die Maus in die Supine-Position stellen und einen fünf Millimeter großen Hautschnitt auf den vorderen Teil des Knies machen. Erweitern Sie den Schnitt den ganzen Weg um das Knie.
Und ziehen Sie die Haut zurück, um das Kniegelenk und die Beinmuskulatur freizulegen. Beginnend mit dem proximalen Ende des Oberschenkelknochens, verwenden Sie eine Zahl von elf Skalpellklinge entlang des Knochens in die distale Richtung zu schneiden. Positionierung der Klinge zwischen der Quadrizeps-Muskelsehneneinheit und der vorderen Seite des Oberschenkelschafts.
Erweitern Sie den Schnitt an der Patella vorbei. Schneiden durch die Mitte der Patellasehne, um die Quadrizeps Muskelsehne Einheit zu entfernen. Als nächstes, beginnend mit dem proximalen Ende des Oberschenkelknochens, positionieren Sie das Skalpellblatt zwischen der hamstring Muskelsehneneinheit und der hinteren Seite des Oberschenkelschafts und schneiden Sie entlang des Knochens in die distale Richtung.
Wenn sich der Schnitt dem Kniegelenk nähert, durchschneiden Sie das Weichgewebe und beenden Sie den Schnitt hinter dem Kniegelenk. Ziehen Sie die Quadrizeps und hamstring Muskeln zurück, um den Oberschenkelknochen freizulegen. Und schneiden Sie überschüssigen Muskel auf den seitlichen und medialen Seiten des Knochens.
Schneiden Sie den Wadenmuskel auf der hinteren Seite der proximalen Tibia. Und kippen Sie das Bein, um die hintere Seite des Oberschenkelknochens zu visualisieren. Entfernen Sie das überschüssige Gewebe um das Kniegelenk, um die distalen Kondylen des Oberschenkelknochens und die hintere Oberfläche der proximalen Tibia freizulegen.
Schneiden Sie die vorderen und hinteren Kreuzbänder weg von den femoralen Kondylen. Und ziehen Sie die Tibia weg vom Oberschenkelknochen, schneiden Sie alle Bänder, um den Unterschenkel vom Oberschenkelknochen zu trennen. Mit der Standard-Sektionsschere den Oberschenkelknochen am proximalen Ende des Knochens etwa acht Millimeter über dem tibiofemoralen Gelenk von der Seitenseite schneiden.
Und verwenden Sie die Zange des Juweliers, um die umgebenden Weichgewebe aus dem Oberschenkelknochen zu entfernen. Dann den Knorpel auf beiden Kondylen am distalen Ende des Oberschenkelknochens aussetzen. Hydrieren Sie regelmäßig die Gelenkoberfläche mit HBSS.
Zur Zerlegung des Humerus die Maus in die Supine-Position legen. Und verwenden Sie Mikroschere, um einen Fünf-Millimeter-Schnitt auf der hinteren Seite des Ellenbogens zu machen. Verlängerung des Schnittes um den Ellenbogen und Zurückziehen der Haut, um die Muskeln am Arm und an der Schulter freizulegen.
Ab dem proximalen Ende des Humerus positionieren Sie die Klinge eines Zahlenelf-Skalpells zwischen der Trizeps-Muskelsehneneinheit und der hinteren Seite des Humerus. Und entlang des Knochens in die distale Richtung geschnitten. Erweitern Sie den Schnitt in Richtung des distalen Endes des Humerus, durch die Trizepssehne und ziehen Sie die Trizeps zurück in Richtung des proximalen Endes des Humerus, bis der Humeralkopf freigelegt wird.
Schneiden Sie das Bindegewebe um den Humeralkopf, ohne die Gelenkoberfläche zu berühren. Und entfernen Sie die Gliedmaße aus dem Körper. Hydratisieren Sie die Gelenkoberfläche des Humeralkopfes mit HBSS.
Um den Humerus vom Arm zu trennen, verwenden Sie Zangen, um das proximale Ende der Ulna auf der hinteren Seite des Arms abzubrechen. Und schneiden Sie das Bindegewebe um das distale Ende des Humerus, entfernen Sie überschüssiges Gewebe auf dem Knochen. Verwenden Sie dann die Standard-Sezschere, um die Delta-Rohrrosität auf der hinteren Seite des Humerus zu entfernen.
Und legen Sie die sezierte Probe in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit HBSS. Für die Calcein AM Färbung der Proben, übertragen Sie die Knochen in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit 500 Mikroliter von 10,05 Mikromolar Calcein in HBSS. Und legen Sie das Rohr in einem Thermomischer bei 37 Grad Celsius bei 800 U/min, vor Licht geschützt.
Nach dreißig Minuten das Exemplar in frischem HBSS für zehn Minuten waschen. Und übertragen Sie die Probe auf das Glasschlitten eines kundenspezifischen, mit dem Mikroskop montierten mechanischen Prüfgeräts, so dass die Gelenkoberfläche der hinteren Femoralkondyles oder der Humeralkopf auf dem Glas sitzt. Hydratisieren Sie die Probe mit HBSS und legen Sie das Gerät mit der Probe auf eine Fluoreszenzmikroskopstufe.
Stellen Sie die mit Calcein AM vor der Lastanwendung unter einer 4-fachen Vergrößerung gebeizten Gelenkchondrozyten dar. Passen Sie die Aufnahmeeinstellungen an, um die Bildqualität zu optimieren. Um eine statische mechanische Belastung anzuwenden, halten Sie eine vorgeschriebene statische Belastung auf die Probe, so dass der Gelenkknorpel fünf Minuten lang gegen das Deckglas gedrückt wird, bevor die Ladung entfernt wird.
Um eine aufprallmechanische Last anzuwenden, lassen Sie einen zylindrischen Stoßdämpfer von bekanntm Gewicht aus einer vorgeschriebenen Höhe auf die Probe fallen und lösen Sie die Last fünf Sekunden nach dem Aufprall. Unmittelbar nachdem eine der beiden Lasten entfernt wurde, inkubieren Sie die Probe in frisch zubereiteten 60 Mikro-Molar-Propridium-Iodid in einem Milliliter HBSS. Fünf Minuten bei Raumtemperatur, dann die Gelenkchdrozyten durch Fluoreszenzmikroskopie neu zu bebilden, wie gerade gezeigt.
Um den Bereich der verletzten und abgestorbenen Zellen aufgrund des angewandten mechanischen Belastungsschemas zu quantifizieren, öffnen Sie zunächst die Mikrographen der Gelenkoberfläche, die vor und nach der Anwendung der mechanischen Belastung in ImageJ erworben wurden. Kombinieren Sie die Bilder zu einem Stapel. Legen Sie den Maßstab der Bilder basierend auf der Bildauflösung fest.
Definieren Sie als Nächstes den Bereich, in dem die Zellen Calcein negativ und PI positiv wurden. Diese Zellen gelten als verletzt oder tot. Bestimmen Sie dann mit dem Messwerkzeug den Bereich der verletzten toten Zellen.
Mindestens sechs getestete angewendet die Ladeprotokolle reproduzierbar induziert quantifizierbare lokalisierte Bereiche der Zellverletzung in Femoral und Humeral knorpeln von acht bis zehn Wochen alten Ventil C Mäuse erhalten. In allen getesteten Belastungsprotokollen verschärften höhere Lastgrößen und höhere Aufprallintensitäten das räumliche Ausmaß der Zellverletzungen sowohl bei Oberschenkelknochen als auch bei Humeri erheblich. Bei der Durchführung der Sezierungen ist es wichtig, daran zu denken, den Gelenkknorpel nicht mit den chirurgischen Werkzeugen in Kontakt zu treten, da dies die Grundlinie durch die Fähigkeit der Proben beeinträchtigen kann.
Die Verwendung dieses Spiegelungsmodells kann die Forschung an Arthrose erleichtern, da die Krankheit bei Mäusen leicht durch genetische, diätetische oder chirurgische Manipulationen induziert wird. Unsere Plattform bietet auch ein Werkzeug für die Aushörung grundlegender wissenschaftlicher Fragen und für das Screening therapeutischer Interventionen, die auf die mechanische Anfälligkeit von Chondrozyten abzielen.
