Этот метод является альтернативой обычной процедуре маркировки флуоресценции и цитометрии потока, которые относят много времени, дорого и несут на себя риск изменения клеточной функции образцов. Основным преимуществом этого метода является трехмерная рефракционная индексная томография и машинное обучение без маркировки и количественные методы, позволяющие быстро и точно идентифицировать лимфоциты. Последствия этого метода распространяются на терапию рака крови и аутоиммунных заболеваний, как выявление лимфоцитов может иметь решающее значение для диагностики заболеваний и соответствующего применения лечения.
Хотя этот метод может обеспечить понимание популяций лимфоцитов, он также может быть применен к анализу других отдельных клеток, представляющих интерес, в том числе бактерий. Визуальная демонстрация технологии 3D количественной фазовой визуализации имеет решающее значение, поскольку она облегчает четкую инструкцию о том, как выполнить технику и может дать представление о ее применении. Начните с сбора каждого подмножества лимфоцитов путем флуоресценции активированной сортировки клеток.
Для оптимальной визуализации разбавляют каждый образец клетки концентрацией 180 клеток на микролитер среды RPMI и медленно впрыскивают 120 микролитров первого разбавленного образца в камеру визуализации. Подтвердив отсутствие пузырьков в камере, поместите каплю дистиллированной воды на объектив объективного 3D-количественного фазового микроскопа и поместите камеру визуализации на стадию перевода микроскопа. Отрегулируйте этап так, чтобы образец согласовыван с объективом цели, и нажмите фокус и поверхность в вкладке калибровки микроскопа перспективы программного обеспечения изображения для регулировки ося позиции объективов цели и конденсатора, соответственно.
Нажмите режим Auto, чтобы выровнять объективы цели и конденсатор. Для оптимизации выравнивания откройте режим сканирования и вручную отрегулируйте линзы, чтобы выровнять цифровой шаблон микромиррора устройства к центру. Затем вернитесь в нормальный режим и отрегулируйте этап перевода, чтобы найти ячейку в поле зрения.
Отрегулируйте осяное положение объектива, чтобы найти фокусную плоскость до тех пор, пока граница образца, визуализирована на экране, не будет почти невидимой. Важно идеально настроить фокус ячейки для создания оптимальной томограммы 3DRI. Если изображение не будет сделано должным образом, 3D-реконструкция будет нарушена, что приведет к шумной томограмме.
Отрегулируйте этап перевода, чтобы найти место без ячейки и нажмите Calibrate, чтобы измерить несколько 2D голограмм с различными углами освещения. Отрегулируйте этап перевода, чтобы найти ячейку в центре поля зрения. И под вкладкой Приобретение, назовите образец, который был изображен.
Нажмите 3D Снимок для измерения голограммы клетки, используя те же углы освещения, как для 2D голограмм просто измеряется. Когда полученные данные появляются в панели управления данными, нажмите на данные и нажмите процесс, чтобы реконструировать 3D рефракционный индекс томограммы из 2D голограмм с помощью алгоритма дефракции томографии реализованы в программном обеспечении изображений. После визуализации в панели управления данными нажмите на данные и нажмите кнопку Open, чтобы визуализировать данные.
Нажмите на центр ячейки, чтобы переместить его и нажмите RI Томограмма на панели менеджера данных. На вкладке Preset нажмите Нагрузку и дважды нажмите лимфоцитов. xml, которая является предопределенной функцией передачи, предоставляемой программным обеспечением для визуализации томограммы в соответствии с дистрибутивами 3DRI.
Прокрутите мышь, чтобы увеличить и перетащить ячейку, чтобы повернуть ее в любом направлении. Для количественной морфологической и биохимической функции извлечения функции поместите все томографические данные в одну папку и разделите типы клеток на отдельные субфолдеры в основной папке. Затем откройте дополнительный файл извлечения функций в соответствующем программном обеспечении для визуализации и отредактировать строку 14 для обозначения папки томограммы, из которой должны быть извлечены данные.
Редактировать строку 15 для обозначения папки, в которую должны быть сохранены извлеченные данные функции, и выполнить код. Для каждой томограммы в наборе данных код будет вычислять площадь поверхности, объем клеток, сферичность, плотность белка и сухую массу на порог рефракционного индекса. Для контролируемого обучения и идентификации используйте простой алгоритм случайного расщепления в MATLAB, чтобы случайным образом разделить извлеченные данные функции на отдельные папки обучения и тестового набора.
Откройте дополнительный учебный файл и отредактировать строку 14 для обозначения папки набора обучения, строку 16 для обозначения папки для сохранения обученного классификатора и строку 17, чтобы установить имя файла для классификатора. Затем выполните код. Используя выбранные функции учебного набора, код будет обучать классификатор с алгоритмом ближайшего соседа K и сохранить классификатор в назначенной папке.
Затем откройте дополнительный тестовый файл три и отредактировать строки с 14 по 15, чтобы назначить обученный классификатор для тестирования и строку 17 для обозначения обученного тестового набора. Затем выполните код. Классификатор определит типы клеток отдельных лимфоцитов в тестовом наборе.
Здесь показаны репрезентативные 3D-рефракционные рефракционные томограммы В-лимфоцитов, CD4 положительные Т-лимфоциты и CD8 положительные Т-лимфоциты с различными цветовыми схемами, выделенные в соответствии с значениями рефракционного индекса, присвоенными с помощью программного обеспечения для визуализации. Из рефракционных значений индекса можно рассчитать количественные морфологические и биохимические особенности. В этом эксперименте точность классификации Т и В лимфоцитов составила 93,15% и 89,81% для учебных и тестовых случаев соответственно.
CD4 положительные и CD8 положительные Т-лимфоциты были статистически классифицированы, и точность была 87,41% и 84,38% для обучения и тестовых наборов соответственно. Наконец, точность многоклассного классификатора типа ячейки составила 80,65% и 75,93% для учебных и тестовых этапов соответственно. Качество и количество изображений имеют важное значение для успеха этой техники.
Чем лучше качество изображения и чем выше объем данных, тем выше точность идентификации. Глубокое обучение может быть использовано для более полного анализа сложных данных томограмм, что значительно повышает производительность идентификации. Кроме того, флуоресценция и 3D количественная фазовая визуализация могут быть использованы для исследования пути физиологических ролей выявленных лимфоцитов.
После своего развития этот метод проложил путь для исследователей в области клеточной биологии и биомедицины для изучения конкретных заболеваний, представляющих интерес в различных организмах. Действительно, иммунологи, в частности, могут извлечь выгоду из использования этой новой технологии для выявления населения, представляющих интерес.
