Этот метод может помочь изучить направления белков с липидными мембранами. В нашем случае, использовать его для анализа кальция зависимых связывания приложений с отрицательно заряженных фосфолипидов. Основные преимущества этого метода в том, что это этикетка бесплатно, чувствительны, количественные, и что взаимодействия могут наблюдаться в режиме реального времени.
Таким образом, позволяет прямой анализ реальных результатов. Этот метод также может быть применен к другим системам, таким как взаимодействие более сложных микромолекулы сборки или даже клетки. Используйте четкие пятимимолярные липидные растворы, описанные в текстовом протоколе.
Смешайте растворенные липиды в желаемом соотношении моляров в 10 миллилитровых стеклянных трубках. Испаряйте органические растворители с помощью сухого потока азота. Оставьте липидную смесь на высокой вакуумной системе лиофилизации в течение трех часов, чтобы удалить любые остаточные следы растворителей.
Теперь, перерасход липидной пленки в один миллилитр буфера цитратов. Инкубировать липидную суспензию при 60 градусах по Цельсию в течение 30 минут в водяной бане, вихревая его энергично каждые пять минут. Эта температура составляет около 10 градусов по Цельсию выше температуры фазового перехода самого высокого плавления липидов в смеси.
Между тем, разогреть экструдер оснащен 50 нанометрового диаметра поры размера поликарбонатной мембраны выше переходной температуры в течение 30 минут. Загрузите мультиламерную подвеску в разогретый экструдер. Аккуратно пройдите смесь 31 раз через поликарбонатную мембрану, чтобы сформировать небольшие униламелларные пузырьки или внедорожники.
Держите температуру выше переходной температуры. Перенесите подвеску внедорожника на двухми миллилитровый пластиковый реакционной сосуд и добавьте буфер цитратов, чтобы довести окончательный объем до двух миллилитров. Инкубировать четыре датчика, вставленные в держатель политетрафторэтилена в 2%SDS раствор, по крайней мере 30 минут.
Затем тщательно промыть их ультра чистой водой, чтобы полностью удалить SDS и попробовать их с помощью потока сухого аргона или азота. Используйте плазменную систему очистки, чтобы полностью удалить любые загрязняющие вещества. Для этого вставьте сухие датчики в плазменную камеру очистки, эвакуируйте камеру и трижды промывьте ее кислородом.
Затем включите очиститель плазмы. Используйте вакуум, высокую радиочастотную мощность и 10 минут времени процесса. После очистки выключите машину и вынули датчики.
Тщательно состыковать плазменные датчики в четыре камеры потока с помощью пинцета. Избегайте какого-либо давления на или кияние камер и труб, которые могут вызвать утечку. Промыть систему цитратным буфером в режиме открытого потока в течение 10 минут.
Запустите программу. Начните записывать любые изменения в частоте и рассеивании первого фундаментального тона и обертонов с помощью программного обеспечения до тех пор, пока базовые уровни частоты и рассеивания не будут стабильными. Когда базовые показатели стабильны, нанесите подвеску внедорожника в буфер цитратов.
Используя реакционной сосуд, удалите 1,5 миллилитров мертвого объема, а затем закройте систему в режиме потока петли. Замечаем сдвиг рассеивания частоты еще на 10 минут. Когда SLB стабилен, уравночные системы с работает буфер при необходимых концентрациях кальция в режиме открытого потока в течение 40 минут.
Добавьте белок в бегущий буфер, содержащий кальций. Выполните применение белка в режиме потока петли до тех пор, пока не будет достигнуто равновесное стабильное состояние. Теперь отмежеваться от связанного белка путем хелатации ионов кальция с пятью миллимолярными EGTA в бегущем буфере в режиме открытого потока.
Регенерировать систему микробаланса с 50 миллилитров двойной дистиллированной воды в режиме непрерывного открытого потока. Снимите трубки с контейнера с водой и дайте системе высохнуть. Аккуратно удалите датчик кристалла и очистите его раствором 2%SDS с помощью держателя полиэтилена.
Высушите видимые части интерьера модуля потока, где был установлен датчик. Здесь показана запись сдвигов частоты и рассеивания. Заметное падение частоты при добавлении липосом, указывает на их поглощение, потому что заполненные буфером пузырьки не жесткие, а вязкие, рассеивание увеличивается.
Впоследствии, сливаются пузырьки разрыва. Сопутствующий выпуск буфера внутри пузырьков уменьшает адсорбированную массу до тех пор, пока не будет достигнуто стабильное плато. Привязка Annexin A2 к липидам добавляет массу, как видно из четкого сдвига частоты, но не мешает структуре билейера, о чем свидетельствует единственное небольшое изменение рассеивания.
Когда ион кальция удаляется хелатирующим агентом, EGTA, Annexin A2 отмежевается от липидной пленки. Частота и записи рассеивания смещаются на уровни, замеченные с бислойом, только указывающие на связывание Annexin A2, полностью зависят от иона кальция и что липидная пленка остается нетронутой. Здесь показан репрезентативный эксперимент отрицательного контроля.
Когда фосфатидилсерин отсутствует, никаких изменений в частоте или рассеивании не проявляется после добавления Annexin A2 в присутствии иона кальция. При попытке этой процедуры, важно обеспечить надлежащее образование bilayer. Используйте липосомы немедленно, в противном случае небольшие пузырьки сливаются в более крупные с меньшим поверхностным натяжением, что может привести к нестабильной базовой линии.
После этой процедуры, количественное описание взаимодействия мембранного белка может быть выполнено для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как сотрудничество по сравнению с некооперативной привязки.
