Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся организации астроцитных сетей в структурах мозга. Основным преимуществом этого метода является то, что он предлагает объективный метод подсчета ячеек метки и документирования их анатомической организации в рамках определенной структуры. Откройте ImageJFIJI, выберите нужный файл и нажмите OK в окне вариантов импорта биоформатов.
Чтобы переопределить стек, который будет содержать только оптические срезы, необходимые для окончательного стека, сначала выберите проект STK и q, а затем нажмите на ручку стека в баре инструментов. Выберите максимальную интенсивность в параметре типа проекции. Сохраните файл и назовите его файл стека.
Если файл изображения содержит несколько каналов, используйте цвет изображения и разделенные каналы, чтобы показать только канал с изображением астроцитной сети. Проверьте настройки пикселей изображения, выбрав изображение, свойства, пиксель, с одним для измерения пикселей. Затем используйте фоновый инструмент вычитания, открыв процесс и вычесть фон для удаления фоновой маркировки биоцитина.
Используйте функцию предварительного просмотра, чтобы установить радиус подвижного шара, который обычно устанавливается на уровне 50 пикселей. Если после вычитания фонового шага требуется дальнейшее снижение шума, выберите процесс, шум и удалите выбросы. Выберите яркий в настройках выбросов и используйте функцию предварительного просмотра для установки радиуса и порога.
Будьте осторожны, используя инструмент удаления выбросов, так как он может размыть данные, как показано здесь. Отрегулируйте порог с помощью изображения, отрегулируйте порог. Выберите режим по умолчанию и B и W.
Нажмите на применить. Преобразование изображения в двоичное изображение с помощью инструмента двоичного процесса, выбрав процесс, двоичный, и сделать двоичный. Сохраните файл в качестве файла tiff и назовите его двоичным файлом.
Для подсчета ячеек сначала установите тип измерения, нажав на анализ и установите измерение. Затем выберите вариант центроидов. Убедитесь, что двоичный файл открыт на экране.
Опять же, откройте меню анализа, и на этот раз выберите анализировать частицы. Далее выберите шоу и очертания. Это создает новый файл, который показывает результат обнаружения.
Оптимизация параметров для уточнения обнаружения. Чтобы обнаружить только клетки, используйте значение размера между 30 и 6000, и круговорот между нулем к одному, где один определяет идеальный круг и ноль случайной формы. Запустите обнаружение, нажав OK. Появятся две таблицы: таблица под названием резюме, в которую приводится количество обнаруженных ячеек, и таблица с озаглавленными результатами, в которых приводятся координаты X и Y каждой ячейки.
Копировать значения и вставлять их в приложение электронной таблицы. Сохраните эту таблицу под таблицей обнаружения имен. Файл с сюжетом обнаруженных ячеек также появится.
Сохраните этот файл в качестве файла tiff под файлом обнаружения имен. Если группа из двух или более помеченных ячеек обнаруживается как одна клетка с инструментом анализа частиц, используйте инструмент водораздела на двоичном изображении, выбрав процесс, двоичный и водораздел перед применением инструмента анализа частиц. Для измерения площади поверхности сетей используйте файл обнаружения в ImageJ.
Слева нажмите мышь, чтобы выбрать инструмент выбора полигонов в панели инструментов. Слева нажмите еще раз, чтобы начать отслеживание области интереса, или рентабельность инвестиций, которая соединяет все ячейки, расположенные на внешней периферии сети. Нажмите правой кнопкой мыши, чтобы закрыть полигон.
Откройте окно измерения набора и выберите вариант области. Затем откройте менеджер рентабельности инвестиций и добавьте отслеживаемый полигон в менеджер рентабельности инвестиций, нажав на добавление. Вы запустите измерение, нажав на меру в менеджере рентабельности инвестиций.
Измерение области появится в таблице и будет выражено в пикселях. Не забудьте преобразовать это значение с коэффициентом преобразования для микроскопа, используемого для получения значения в квадратных микрометрах. Откройте файл стека в ImageJFIJI и определите исправленную ячейку с ее более сильной интенсивностью маркировки.
Затем откройте таблицу обнаружения файла, названную в приложении электронной таблицы, и найдите номер, связанный с исправленной ячейкой и ее соответствующими координатами. Если вы не в состоянии точно определить исправленную клетку, используйте полигон, чтобы окружить область, где отложение биоцитина плотнее, и обратитесь к этому положению, как у исправленной клетки. Используйте менеджер рентабельности инвестиций, как и прежде, чтобы нарисовать рентабельность инвестиций в исправленное местоположение ячейки и добавить его в менеджер рентабельности инвестиций.
Затем установите измерение и выберите вариант центроида. В менеджере РИО нажмите на меру, чтобы получить координаты центроида отслеженной области. Используйте эти координаты в качестве точки отсчета для этой конкретной сети.
Используйте эту формулу для расчета координат каждой клетки со ссылкой на исправленный астроцит. Выражение координат каждой клетки со ссылкой на исправленный астроцит является важным шагом для расчета вектора из исправленных астроцитов. Используйте эту формулу для расчета координат основного вектора преференциальной ориентации.
Основным вектором преференциальной ориентации сети является сумма всех ранее рассчитанных векторов для каждой ячейки, состоящей в сети. Разделите длину основного вектора на количество ячеек в сети, минус один, чтобы исключить исправленную ячейку, нормализовать значения и обеспечить сравнение между сетями. Чтобы определить положение каждой сети в ядре интереса, сначала откройте четыре x изображения с вектором редактора изображений.
Умножьте размеры в окне измерения на пять, чтобы увеличить размер изображения 4 x. Здесь изображение было отобрано на 800 на 800 пикселей, и поэтому разрешение выборки изменено на 4000 на 4000 пикселей. Экспорт файла в формате tiff и назовите его resized 4 x.
Выровнять левый верхний угол изображения с четырьмя х с нижней левой части документа Adobe Illustrator. Программное обеспечение предоставляет координаты из нижнего левого угла референтной точки. Откройте 20 x изображение сети.
Используйте двоичный файл или файл обнаружения, потому что они легче выровнять. Затем играйте с инструментом непрозрачности в двоичном файле изображения 20 x, чтобы выровнять его с миг-изображением 4 x. Когда выравнивание будет сделано, выберите и удерживайте инструмент пипетки, чтобы инструмент измерения появился, и выберите его в левой панели инструментов.
Используйте инструмент измерения, чтобы нажать на левый верхний угол изображения 20 x, чтобы получить координаты 20 х референциальной точки на повторное изображение 4 x. Эти референтные координаты 20 x полезны для выражения положения каждой сети на схематическом рисунке ядра. Подводя итог данным, используется нормализация ядра как прямоугольника.
Для этого используйте полигон, чтобы окружить ядро в повторном изображении четыре x. Затем откройте менеджер рентабельности инвестиций и добавьте нарисованную рентабельность инвестиций. Используйте изображение с прозрачными огнями, если границы ядра не видны, и в этом случае не забудьте изменить его в первую очередь.
При измерении набора выберите параметр связанного прямоугольника для расчета малейшего прямоугольника внутри нарисованного ядра. Наконец, нажмите меру, а затем следуйте шагам в письменном протоколе, чтобы выразить помеченные координаты ячеек в нормализованном ядре, представленном связанным прямоугольником. Один астроцит в спинной части тригеминального основного сенсорного ядра, помеченный SR101, был направлен на цельноклеточную запись и заполнен биоцитином 0,2%.
Электрическая стимуляция пятого тракта увеличила маркировку биоцитином в спинной части тригеминального основного сенсорного ядра, что представляет собой увеличение количества соединенных клеток. Астроцитные сети остаются ограниченными в спинной части тригеминального основного сенсорного ядра и их основной ориентации. Этот метод был разработан для позиционирования астроцитных сетей в пределах определенной структуры, но может быть использован для выражения положения популяции помеченных клеток в любой структуре.
