Этот метод ответил на ключевые вопросы в этой области, такие как, как генерировать человека печени химерик модели мыши, семейная гиперхолестеринемия. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет проводить тесты на наркотики in vivo. Этот метод имеет синдикации для лечения семейной гиперхолестеринемии.
В качестве новой терапии этого заболевания, он может быть протестирован с помощью таких химерных моделей животных. Хотя этот метод может обеспечить понимание семейной гиперхолестеринемии, он также может быть применен к другим наследственным заболеваниям печени. За 24 часа до engraftment, оттепель 40 микролитров внеклеточной матрицы на мышь, поместив в холодильник, в холодной комнате.
Охладите инсулиновый шприц для каждой мыши, которая будет введена и коробку 200 микролитров советы в четыре градуса по Цельсию холодильник. За час до engraftment, тепло фермента диссоциации клеток, дополненный 50 микрограммов на миллилитр DNAase 1, к комнатной температуре и место RPMI 1640 среды, дополненный 20 процентов замены сыворотки на льду. Возьмите фазы контрастные изображения iHeps для записи их статуса, в том числе морфологии клеток, роста и плотности клеток.
Далее, мыть каждый колодец iHeps с 2 миллилитров комнатной температуры кальция и магния ион-бесплатно PBS в два раза, а затем добавить один миллилитр предварительно разогретого фермента диссоциации клеток к каждому хорошо. Верните клетки в инкубатор на 8-10 минут. Мониторинг морфологии клеток под микроскопом.
Когда большинство клеток становятся круглыми, добавить в равном объеме холодной среды на колодец, пипетки клетки осторожно отделить от пластины, и передать клеточной подвески в новую трубку 15 миллилитров. Этот шаг имеет решающее значение для надежности гепатоцитов. Если клетки трудно отделить от пластины, некоторые из них могут быть оставлены на пластине.
А если клетки отсоединяются, то пипетка аккуратно после центрифугации, чтобы получить одноклеточную подвеску. Повторите процедуру отслоения клеток для каждой хорошо, пока почти все прилагаемые клетки не будут собраны. Затем центрифуга при 200 г в течение трех минут при четырех градусах по Цельсию.
После центрифугации удалите супернатант и повторно приостановив клетки двумя миллилитров холодного PBS в пятнадцати миллилитровой трубке. Пипетт клетки мягко, чтобы получить одноклеточную подвеску. Затем перейдите клетки через 40 микрон-клеточный ситечко для удаления агрегатов.
Как правило, от одного до двух миллионов клеток о могут быть собраны после нескольких тер-ING. Далее добавьте микролитеры 0,4 процента trypan синий раствор 20 микролитров клеточной подвески. Подсчитайте клетки и замечите концентрацию клеточной подвески как C.Calculate необходимый объем клеточной подвески, чтобы ввести один миллион клеток на мышь.
Затем выделите необходимый объем клеточной суспензии на 15 миллилитровых трубок и центрифуг при 200 г в течение трех минут при четырех градусах Цельсия. После удаления супернатанта, повторно приостановить клетки в 27,5 микролитров холодного PBS на мышь. А затем добавить равный объем внеклеточной матрицы для конечного объема 55 микролитров на мышь.
Теперь поместите один из холодных инсулиновых шприцев на лед. Отключите поршень, перенесите 55 микролитров клеточной подвески в шприц, а затем положите поршень обратно. Разгрузить пузырьки осторожно, и положить шприц обратно на лед.
Убедитесь, что мышей LRG должным образом анестезировали перед началом процедуры инъекции. Нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость во время процедуры анестезии. После того, как мышь потеряла мышечный рефлекс для стимуляции, поместите его в правильном, боковом, decubitus позиции.
Нанесите толстый слой депиляативного крема на область разреза на левом фланге и оставьте на пять-восемь минут. Удалите крем для депиляния и волосы, вытирая область с увлажненной водой марлевой площадкой. Скраб левый фланг с 70 процентов этанола в три раза.
Затем найдите селезенку, которую можно увидеть на левом фланге. Затем окончательное замачивания с бетадином для дезинфекции. После использования ножниц, чтобы сделать 0,5 до одного сантиметра разрез в коже и брюшной стенке, использовать миппы для экстерьеризации селезенки, осторожно потянув окружающих жировой ткани.
Аккуратно стабилизировать селезенку с помощью тампона. Вставьте иглу инсулинового шприца три-четыре миллиметра в паренхиму селезенки и аккуратно ввишите около 50 микролитров клеточной суспензии. Убирать иглу и поместить ватный тампон над инъекцией в течение одной минуты, чтобы предотвратить кровотечение и утечку материала.
Верните селезенку в брюшовую, и закройте рану пятиох нейлоновыми швами. После за шва поместите мышь в чистую клетку с легким доступом к пище и воде. Начните с удаления внутренних органов из свежеухватанной мыши так, чтобы была видна нисходящая аорта, параллельная позвоночнику.
Затем вскрыть соседние ткани, и удалить сердце. Используйте тонкие ножницы, чтобы вскрыть аорты, поместив каждый из них в холодный, кислородом Krebs раствор. После сбора перенесите аорты в раствор кребса в силиконовую чашку Петри.
Прикрепите соединительной ткани, чтобы исправить положение аорты, не растягивая его. Под стерильным микроскопом используйте тонкие типсы и пружинные ножницы, чтобы вскрыть аорту, свободную от окружающего жира и приключенческой ткани, не повреждая стенку сосуда. Затем разрежьте каждую аорту на сегменты длиной от полутора до двух миллиметров.
Затем вырежьте двухметровый кусок 40 микрон толщиной нержавеющей проволоки, и аккуратно вставьте в люмен аорты. Держите провод для переноса сегмента в проволочную миографическую камеру, наполненную кислородным раствором Кребса. Чтобы измерить длину сегментов аорты при изучении контрактности, поместите каждый сегмент перпендикулярно между челюстями и запикаете показания D1 на микрометре.
Затем удалите сегмент и переместить челюсти вместе. Запись чтения D0 и рассчитать длину сегмента. Затем зажим провода и закрепте его отверткой, поместив неимовеченный сегмент между челюстями.
Для нормализации перед экспериментом установите миограф до нуля в непротянутом положении. Затем медленно перемещать челюсти друг от друга и наблюдать аорты изменения напряжения до достижения трех millinewton. Через 15 минут вылейте раствор из миографической камеры и замените свежим раствором Кребса.
Прожгев еще 15 минут, снова отрегулируйте напряжение до трех миллиньютонов. Затем измените стандартный раствор Кребса на раствор Кребса, дополненный хлоридом калия 60 миллимолярия, чтобы вызвать сокращение в течение не менее пятнадцати минут. Промыть свежим раствором Кребса три раза, затем добавить увеличение концентрации фенилэфрина.
Например, от 10 наномолярных до 100 микромолеров. Затем, после промывания стандартным раствором Кребса, добавьте одну концентрацию фенилэфрина, около 70 процентов максимального сокращения. Когда сокращение является стабильным, добавить увеличение концентрации ацетилхолина с двухминутными интервалами.
Например, от одного до трех наномолярных до десяти до тридцати микромолеров, чтобы вызвать вазодилатации. На этом снимке показано репрезентативное цельное сканирование изображения окрашивания человеческого альбумин в печени мыши, заселенной липопротеиновыми рецепторами низкой плотности. Стрелки указывают на скопления человеческих iHeps, присвятанные в печень мыши.
Кластеры engrafted человека iHeps видны более подробно здесь. На этом графике рассеяния показан процент заселенных человеческих альбуминовых положительных клеток, соответствующих iHep, содержащим участки в печени мыши, от различных донорских iPSCs. Это репрезентативное изображение иммуногистохимического окрашивания для ядер человека в печени мыши, с приписки семейной гиперхолестеринемии iHeps.
График бара показывает процент заселенных человеческих ядер положительные iHeps от различных донорских iPSCs в печени мыши LRG. Это репрезентативные изображения человеческого альбумин и человеческих ядер окрашивания на двух последовательных участках печени мыши, заселенных диким типом iHeps. Наконец, это изображение показывает эндотелий-зависимых вазодилатации аорты в семейной гиперхолестеринемии печени человека химерных мышей, в ответ на увеличение концентрации ацетилхолина.
После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как генерировать человека печени химерных мышей, используя человека iPSC полученных гепатоцитов.
