Este método tem respondido a perguntas-chave no campo, como como gerar um modelo de camundongo quimérico hepático humano, hipercolesterolemia familiar. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a realização de testes medicamentosos in vivo. Esta técnica tem sindicância para os tratamentos de hipercolesterolemia familiar.
Como uma nova terapia para esta doença, ela pode ser testada usando tais modelos de animais quiméricos. Embora este método possa fornecer uma visão da hipercolesterolemia familiar, ele também pode ser aplicado a outras doenças hepáticas hereditárias. 24 horas antes do enxerto, descongele 40 microliters de matriz extracelular por rato, colocando em uma geladeira, em uma sala fria.
Esfrie uma seringa de insulina para cada rato ser injetado e uma caixa de 200 pontas de microliter em uma geladeira de quatro graus Celsius. Uma hora antes do enxerto, aqueça a enzima de dissociação celular, suplementada com 50 microgramas por mililitro de DNAase 1, à temperatura ambiente e coloque rpmi 1640 médio, complementado com 20% de substituição de soro no gelo. Faça imagens de contraste de fase de iHeps para registrar seu status, incluindo morfologia celular, crescimento e densidade celular.
Em seguida, lave cada poço de iHeps com 2 mililitros de cálcio de temperatura ambiente e PBS sem íons de magnésio duas vezes e, em seguida, adicione um mililitro da enzima de dissociação celular pré-aquecida a cada poço. Devolva as células à incubadora por oito a dez minutos. Monitore a morfologia celular sob o microscópio.
Quando a maioria das células se tornar redonda, adicione o mesmo volume de meio frio por poço, pipeta as células suavemente para se soltar da placa, e transfira a suspensão celular para um novo tubo de 15 mililitros. Este passo é fundamental para a confiabilidade dos hepatócitos. Se as células são difíceis de se desprender da placa, algumas podem ser deixadas na placa.
E se as células se soltarem, pipeta suavemente após a centrifugação, para obter uma suspensão unicelular. Repita o procedimento de desprendimento celular para cada poço até que quase todas as células anexadas sejam coletadas. Em seguida, centrífuga a 200 g por três minutos a quatro graus celsius.
Após a centrifugação, remova o supernasce e suspenda as células com dois mililitros de PBS frio no tubo de quinze mililitros. Pipeta as células suavemente para obter uma suspensão de célula única. Em seguida, passe as células através de um coador de células de 40 mícrons para remover agregados.
Normalmente, de um a dois milhões de células podem ser colhidas depois de poucos ter-ing. Em seguida, adicione microliters de 0,4% solução azul Trypan a 20 microliters de suspensão celular. Conte as células e regise a concentração de suspensão celular como C.Calcule o volume necessário de suspensão celular para injetar um milhão de células por rato.
Em seguida, aloque o volume necessário de suspensão celular em tubos de 15 mililitros e centrífuga a 200 g por três minutos a quatro graus Celsius. Depois de remover o supernascer, suspenda as células em 27,5 microliters de PBS frio por rato. E, em seguida, adicionar um volume igual de matriz extracelular para um volume final de 55 microliters por mouse.
Agora, coloque uma das seringas de insulina fria no gelo. Desligue o pistão, transfira 55 microliters de suspensão celular para a seringa e, em seguida, coloque o pistão de volta. Descarreja as bolhas cuidadosamente, e coloque a seringa de volta no gelo.
Certifique-se de que os camundongos LRG estejam devidamente anestesiados antes de iniciar o procedimento de injeção. Aplique pomada veterinária sobre os olhos para evitar o ressecamento durante o procedimento de anestesia. Uma vez que o rato tenha perdido o reflexo muscular para a estimulação, coloque-o na posição direita, lateral, decúbito.
Aplique uma camada grossa de creme depilatório na área de incisão no flanco esquerdo e deixe por cinco a oito minutos. Remova o creme depilatório e o cabelo limpando a área com uma gaze umedecido pela água. Esfregue o flanco esquerdo com 70% de etanol três vezes.
Em seguida, localize o baço, que pode ser visto no flanco esquerdo. Seguido de uma imersão final com betadina para desinfecção. Depois de usar uma tesoura para fazer uma incisão de 0,5 a um centímetro na pele e na parede abdominal, use fórceps para exteriorizar o baço puxando suavemente o tecido adiposo circundante.
Estabilize suavemente o baço usando um cotonete. Insira a agulha da seringa de insulina de três a quatro milímetros no parenchyma do baço, e injete suavemente aproximadamente 50 microliters de suspensão celular. Retire a agulha e coloque um cotonete sobre a injeção por um minuto para evitar sangramento e derramamento de material.
Devolva o baço ao peritônio e feche a ferida com suturas de nylon de cinco. Após a sutura, coloque o rato em uma gaiola limpa com fácil acesso a comida e água. Comece removendo os órgãos internos do camundongo recém-eutanizado para que a aorta descendente, paralela à coluna vertebral, seja visível.
Em seguida, dissecar o tecido adjacente e remover o coração. Use uma tesoura fina para dissecar a aortae, colocando cada uma em solução krebs fria e oxigenada. Após a coleta, transfira a aortae em solução Krebs para uma placa de Petri revestida de silicone.
Fixar o tecido conjuntivo para fixar a posição da aorta sem esticá-la. Sob um microscópio estéril, use fórceps finos e tesouras de mola para dissecar a aorta livre da gordura circundante e tecido aventureiro sem danificar a parede do vaso. Em seguida, corte cada aorta em segmentos de um e meio a dois milímetros de comprimento.
Em seguida, corte um pedaço de dois centímetros de comprimento de fio inoxidável de 40 mícrons de espessura, e insira suavemente no lúmen de aorta. Segure o fio para transferir o segmento para a câmara de miógrafo de arame, cheia de solução krebs oxigenada. Para medir a duração dos segmentos de aortae ao estudar a contrariedade, coloque cada segmento perpendicularmente entre as mandíbulas e registe a leitura D1 no micrômetro.
Em seguida, remova o segmento e mova as mandíbulas juntas. Registo a leitura D0 e calcule a duração do segmento. Em seguida, aperte o fio e fixe-o com a chave de fenda enquanto coloca o segmento não estendido entre as mandíbulas.
Para normalização antes do experimento, ajuste o miógrafo como zero na posição não estendida. Em seguida, mova lentamente as mandíbulas e observe a tensão da aorta mudar até atingir três mililitros. Após 15 minutos, drene a solução da câmara de miógrafo e substitua por uma solução krebs fresca.
Depois de esperar mais 15 minutos, ajuste novamente a tensão para três mililitros. Em seguida, mude a solução padrão krebs para a solução Krebs complementada com cloreto de potássio de 60 milialares, para induzir a contração por pelo menos quinze minutos. Enxágüe com solução krebs fresca três vezes, em seguida, adicione concentrações crescentes de fenilefrina.
Por exemplo, 10 nanomolar a 100 micromolar. Em seguida, depois de lavar com a solução padrão krebs, adicione uma única concentração de fenilefrina, a cerca de 70% da contração máxima. Quando a contração estiver estável, adicione concentrações crescentes de acetilcolina em intervalos de dois minutos.
Por exemplo, de um a três nanomolar a dez a trinta micromolar para induzir a vasodilatação. Esta imagem mostra uma imagem representativa digitalizada de uma coloração de albumina humana em um fígado de rato repovoada com iHeps deficientes de receptor de lipoproteína de baixa densidade. Setas indicam aglomerados de iHeps humanos engrafados no fígado do rato.
Os aglomerados de iHeps humanos engrafados são vistos com mais detalhes aqui. Este gráfico de dispersão mostra a porcentagem de células positivas de albumina humana repovoadas correspondentes ao iHep contendo áreas no fígado do rato, de diferentes iPSCs doadores. Esta é uma imagem representativa da coloração imunohistoquímica para núcleos humanos em um fígado de rato, com hipercolesterolemia familiar engrafada iHeps.
O gráfico da barra mostra a porcentagem de núcleos humanos repovoados iHeps positivos de diferentes iPSCs doadores em fígados de camundongos LRG. Estas são imagens representativas da albumina humana e da coloração de núcleos humanos em duas seções consecutivas de um fígado de rato, repovoadas com iHeps tipo selvagem. Finalmente, esta imagem mostra a vasodilatação dependente do endotélio da aorta em camundongos quiméricos hepáticos humanos hipercolesterolemia familiar, em resposta ao aumento das concentrações de acetilcolina.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar camundongos quiméricos hepáticos humanos, usando hepatócitos derivados do iPSC humano.
