Этот протокол позволил использовать конфокальный лазерно-сканирующий волоконно-оптический эндомикроскоп для одновременной визуализации и электрофизиологической регистрации in vivo в течение нескольких часов с нервных структур на любой глубине мозга у бодрствующего или относительно наркозного животного. Мы разработали безболезненный метод фиксации, который позволяет проводить глубокую визуализацию мозга у бодрствующих животных, используя методы, аналогичные тем, которые ранее использовались для электрофизиологических записей. Данный метод был использован для изучения функциональных сосудистых аномалий на моделях эпилепсии и возрастной макулярной дегенерации у грызунов.
Это эффективный метод оценки вклада патологии кровотока во многие, если не в большинство органов заболевания. Несмотря на то, что эта методика была разработана для изучения динамики кровотока в головном мозге в режиме реального времени, мы использовали ее для изучения кровотока в сетчатке in vivo. Она не ограничивается сосудистыми исследованиями в нервной ткани.
Процедуру будет демонстрировать Хосе Мария Гонсалес Мартин, высококвалифицированный техник из моей лаборатории. Убедившись в отсутствии реакции на лепестковый рефлекс, поместите зубы внутрь отверстия прикусной планки, и стабилизируйте голову мыши в стереотаксической рамке грызуна. Затяните носовой зажим до плотного прилегания.
Положение тела должно быть максимально прямым. Используйте амбушюры с манжетами держателя челюсти, чтобы зафиксировать голову так, чтобы скуловые отростки черепа находились внутри зажима. После очистки и стерилизации кожи головы сделайте разрез от 12 до 15 миллиметров вдоль средней линии от основания черепа до межглазья вдоль сагиттальной средней линии черепа и используйте четыре 28-миллиметровых зажима Bulldog serrefine, чтобы втянуть границы кожи головы, обнажив череп и максимально увеличив рабочую зону.
Соскребите надкостницу до краев разреза и высушите верхнюю часть черепа. Измерьте высоту черепа на любом расстоянии позади брегмы и на двух равных расстояниях латерально от средней линии по обе стороны черепа. Определите целевую точку, правый гиппокамп, с помощью стереотаксического атласа.
На черепе найдите координаты целевой точки относительно брегмы с помощью стереотаксиса и с помощью хирургического маркера отметьте четыре угла окна визуализации размером 1,4 на два миллиметра, центрированные вокруг целевой точки прямо над гиппокампом. С помощью хирургического маркера нарисуйте дополнительную отметку над верхней левой теменной костью, а другую — над правой лобной костью для костных винтов. С помощью маркера нарисуйте по одной точке в один миллиметр с каждой стороны от средней линии и одну точку на средней линии на один миллиметр позади лямбды, чтобы обозначить точки введения эпидурального регистрирующего электрода ЭЭГ.
Чтобы установить колпачок головы, снабдите стоматологическую бормашину бормашинкой диаметром 0,7 миллиметра и осторожно просверлите два небольших отверстия в черепе в местах установки костного винта. Затем поместите в каждое отверстие один стерилизованный на 70-80% этанол четырехмиллиметровый прорезной винт из нержавеющей стали диаметром 0,85 дюйма, следя за тем, чтобы кончики винтов не выступали за нижнюю часть кости в полость черепа. Затем используйте L-образную специальную выравнивающую деталь, прикрепленную к микроприводу, установленному на стереотаксическом устройстве, чтобы выровнять крышку головки по средней линии с передним гребнем, перекрывающим брегму, и вставьте два приводных винта с шлицевой головкой филлистера над брегмой, пока винты не лягут ровно на череп, стараясь не оказывать слишком сильного давления на череп.
Чтобы настроить окно визуализации, просверлите отверстие для заусенцев диаметром 0,7 мм в каждом из положений контрольных меток краниотомии для углов окна визуализации, прежде чем использовать сверло, чтобы аккуратно очертить периферию окна краниотомии размером 1,4 на два миллиметра с итеративно более глубокими разрезами. Накройте открытое окно костным воском и используйте жернова диаметром 0,9 мм, чтобы просверлить отверстия для эпидуральных электродов ЭЭГ, стараясь не прорезать дюраматер. Закройте три отверстия костным воском и постройте стенку из стоматологического цемента, которая охватывает окно визуализации и отверстия для ЭЭГ, чтобы связать стенку с головным колпачком.
Когда цемент высохнет, используйте черный плетеный шелк 4.0 или 5.0 и простые прерывистые швы, чтобы закрыть свободные края раны, и используйте аппликатор с ватным наконечником, чтобы нанести лидокаин и антибактериальные мази на открытые участки кожи. Затем поместите мышь в теплую клетку с наблюдением до полного выздоровления. Через день после обследования по имплантации головного колпачка закрепите его на специальной монтажной планке, прикрепленной к стереотаксической раме, чтобы надежно расположить пробужденную мышь на раме во время сеанса визуализации.
Вставьте наземные эпидуральные регистрирующие электроды ЭЭГ в заднее центральное отверстие, а регистрирующие электроды — в передние левое и правое отверстия. Кончики проволоки имеют L-образную форму и расположены между черепом и дюраматером. Чтобы визуализировать кровоток в гиппокампе, закрепите хвост двумя пальцами, чтобы найти центральную вену, и, держа ультратонкий инсулиновый шприц, оснащенный встроенной иглой 30-го калибра, параллельной хвосту, введите иглу скошенной стороной вверх в вену примерно на полпути к двум третям от основания хвоста, чтобы доставить 200 микролитров 5%-ного зеленого флуоресцеина, фиксируемого лизином декстрана.
Затем с помощью изогнутого кончика иглы шприца удалить твердую мозговую оболочку и начать запись конфокального лазерного сканирования. Непосредственно после инъекции в хвостовую вену прижмите скошенный оптоволоконный пучок длиной 300 микрон к подвижному манипулятору роботизированного стереотаксического привода в нисходящей ориентации. Удерживающая система позволяет регистрировать стабильный кровоток в глубоких микрососудах головного мозга, включая капилляры и их проксимальные клетки стенки, в течение долгих часов.
В этом репрезентативном анализе целых микрососудов наблюдалась остановка кровотока в меченых клетках стенки. Количество записей волокон может быть определено путем сравнения записей двухфотонной визуализации кровотока с высоким разрешением с эквивалентными вазоспазмами в кортикальной ткани. Иммуногистохимический анализ в местах регистрации показывает, что с помощью этого метода правильно воздействуют на клетки стенки гиппокампа, не только сужаясь в ответ на лечение, но и пространственно связываясь со стриктурами в микрососудах, удаленных от артерий.
Навыки стереотаксической хирургии и инъекции боковой хвостовой вены имеют решающее значение для выполнения этого протокола. Тщательная практика необходима для уменьшения количества ошибок и повышения точности. Метод позволяет в режиме реального времени визуализировать динамику кровотока в глубоких структурах головного мозга, что делает его пригодным для изучения патологий сосудистой системы и оценки эффективности лечения, направленного на них.
