Поясничная интратекальная инъекция векторов генной терапии для таргетирования центральной нервной системы у мышей и крыс

Поясничная интратекальная инъекция представляет собой трансляционно релевантный путь введения генной терапии в центральную нервную систему. Этот всеобъемлющий стандартизированный протокол для интратекальных инъекций поясничного отдела новорожденных, молодых и взрослых мышей и крыс призван помочь исследователям использовать эту технику для доклинических исследований генной терапии.

Одним из методов воздействия на центральную нервную систему для лечения неврологических заболеваний является использование поясничного интратекального пути введения. Этот подход обходит гематоэнцефалический барьер для прямого доступа к спинномозговой жидкости и преимущественно нацелен на клетки центральной нервной системы. Многочисленные опубликованные доклинические исследования с использованием поясничного интратекального пути инъекции способствовали развитию клинических испытаний генной терапии; Однако описанные протоколы изменчивы и рассредоточены по нескольким ресурсам. Здесь представлен полный набор протоколов интратекальных инъекций поясничного отдела новорожденным, ювенильным и взрослым мышам и крысам для доклинических исследований генной терапии. При правильной подготовке эту технику инъекций можно выполнить быстро и надежно. В дополнение к подробному описанию протокола инъекции на каждой стадии развития, обсуждаются связанные с этим параметры, такие как объем инъекции, которые могут повлиять на результаты исследования. Чтобы продемонстрировать применение поясничных интратекальных инъекций для воздействия на центральную нервную систему, представлена экспрессия аденоассоциированного вируса серотипа 9 в головном мозге, спинном мозге и периферических тканях после успешной или неудачной инъекции.

Проблема в лечении неврологических заболеваний, которые требуют глобальной доставки через центральную нервную систему (ЦНС), но в остальном являются хорошими кандидатами для генной терапии, в значительной степени объясняется неэффективным нацеливанием на ЦНС и соответствующие типы клеток¹. В настоящее время проводится значительный объем исследований по оптимизации глобального нацеливания на клетки и ткани ЦНС путем разработки средств доставки ^1,2. Тем не менее, достаточно широкая доставка векторов все еще может быть достигнута с помощью современной технологии генной терапии векторов с использованием определенных комбинаций вирусных векторов и путей введения ^3,4. В настоящее время золотым стандартом для получения широкой доставки ЦНС в результате однократного лечения является использование аденоассоциированного вируса серотипа 9 (AAV9) вместе с прямой инъекцией в спинномозговую жидкость (ликвор).

Существует три типичных пути введения для прямых инъекций спинномозговой жидкости: поясничный интратекальный (IT), внутримозговой (ICV) и интрацистернальный (ICM)⁵. Каждый из этих путей введения приводит к различным паттернам биораспределения в ЦНС и периферических тканях, но все они имеют преимущество в обходе гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) для достижения клеток ЦНС, которые способствуют патологии неврологических заболеваний и фенотипам⁶. Инъекция ИТ в поясничный отдел позвоночника является стандартом для клинического использования при доставке лекарств людям, поскольку клиническая процедура является рутинной и простой, с меньшей инвазивностью по сравнению с инъекциями ICV и ICM.

Инъекции ИТ в поясничном отделе позвоночника являются признанной методикой, которая широко используется в области анестезии и обезболивания, первая статья была опубликована в 1885 году^. Первый протокол инъекций ИТ в поясничном отделе позвоночника у взрослых мышей был опубликован в 1980^году8, и с тех пор он был широко принят и пересмотрен⁹. В эти протоколы были внесены небольшие коррективы или усовершенствования 10,11,12, включая метод сохранения продукта ¹³. Протоколы инъекций ИТ в поясничном отделе позвоночника взрослым крысам также были впервые опубликованы в 1976 году, с катетеризацией при хроническом введении¹⁴ и прямой инъекцией при однократном лечении¹⁵. Совсем недавно группы опубликовали протоколы инъекций ИТ в поясничный отдел у неонатальных или молодых мышей и крыс ^16,17.

Широкое внедрение и валидация этого метода обхода ГЭБ и клеток-мишеней в ЦНС привели к многочисленным успешным доклиническим и клиническим исследованиям генной терапии для лечения неврологических заболеваний. Положительные данные об эффективности и безопасности у мышей, крыс и приматов, моделирующих неврологические заболевания, вызвали волнение и интерес к потенциальной клинической пользе для этих заболеваний 18,19,20,21,22,23. Некоторые из этих исследований в настоящее время проходят клинические испытания (например, идентификаторы clinicaltrials.gov NCT02362438, NCT04737460, NCT03381729 и NCT05518188)^3,6. В этой статье описан простой протокол инъекций поясничного отдела IT мышам и крысам разного возраста, без удаления спинномозговой жидкости, который может быть использован для проектов трансляционной генной терапии. Этот протокол похож на уже имеющиеся протоколы, которые широко распространены; Тем не менее, имеет смысл процитировать эти соответствующие протоколы в одном месте для легкого доступа и ознакомления, вместе с сопутствующими видеовизуальными материалами. Этот протокол объясняет инъекцию неонатальным мышам и крысам в постнатальный день (P) 0-1 и молодым мышам и крысам P21, с репрезентативными результатами успешной и неудачной инъекции ИТ в поясничный отдел позвоночника в P1 у мышей. В ходе обсуждения рассматриваются распространенные ошибки и конкретные детали, требующие пристального внимания при выполнении этой процедуры, а также рекомендации о том, как практиковать эти инъекции до начала доклинического исследования.

Описанные здесь процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Юго-западном медицинском центре Техасского университета. Самцы и самки мышей дикого типа C57BL6/J в возрасте P1-P28 использовались для протоколов с участием мышей. Самцы и самки крыс дикого типа Sprague-Dawley в возрасте P1-P56 использовались для протоколов с участием крыс. За исключением операции по выживанию, описанной в разделе 3, все остальные процедуры вызывают лишь кратковременный дискомфорт и не требуют использования анестетиков или анальгетиков. Люди должны следить за лабораторными животными на предмет большего, чем кратковременный дискомфорт, и обращаться за рекомендациями к своему персоналу IACUC и ветеринарному персоналу о необходимости использования анестетиков и анальгетиков. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании представлена в Таблице материалов.

1. Поясничная IT-инъекция мышам >P21

1. Подготовка
   1. Приготовьте растворы для инъекций, включая вектор для генной терапии в желаемой концентрации (концентрациях) и контрольный раствор (обычно буфер для рецептуры, используемый при производстве векторов). Инъекционные растворы должны быть стерильными и оставаться стерильными на протяжении всей процедуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы должны оставаться на льду в течение всей процедуры.
   2. Соберите и продезинфицируйте все материалы, включая шприц и иглу, пипетку и раствор для инъекций. Следуйте организационным рекомендациям по использованию шкафов биобезопасности и воздействию инъекционных средств. Описанные здесь процедуры проводились в шкафу биобезопасности класса 2.
   3. С помощью микролитровой пипетки отмерьте нужный объем инъекционного раствора и переложите его на стерильную парафиновую пленку. Обычно используется объем инъекции 5 μл, который рассматривается как целевой объем для взрослых мышей >P21 (Таблица 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости объем можно увеличить; Тем не менее, за животными следует тщательно следить на предмет побочных реакций на большие объемы инъекций. Смотрите раздел «Обсуждение» для получения подробной информации об объеме инъекций и побочных реакциях. Раствор также можно переносить непосредственно с наконечника пипетки на шприц или использовать калиброванные газонепроницаемые микролитровые шприцы для непосредственного измерения объема раствора для инъекций.
   4. Наберите раствор в микролитровый шприц с помощью иглы 30 г 0,5 дюйма, стараясь не набрать пузырьки воздуха.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Калибр и длина иглы могут повлиять на проникновение в кожу. При рассмотрении размера используемого шприца объем инъекции не должен быть менее 10% от емкости шприца. При объемах, превышающих 50% емкости шприца, убедитесь, что поршень можно легко нажать указательным пальцем. Если поршень не может быть легко нажат, используйте шприц большей емкости.
2. Сдерживающий
   1. Доминирующей рукой держите находящуюся в сознании (необезболивающую) мышь за хвост на бумажном полотенце. Бумажное полотенце поможет сдержать, успокоить, а мышь не укусит. Мышь должна находиться в нейтральном положении лежа так, чтобы боковая сторона тела была обращена к вам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости обучать или приучать мышей к этому ограничителю до процедуры. Мыши могут испытывать трудности из-за сдержанности, но не должны вызывать специфическую болевую реакцию. Если наблюдается более чем кратковременная реакция на боль, может потребоваться введение анальгетиков; Обратитесь за ветеринарной помощью.
   2. Недоминирующей рукой сложите часть бумажного полотенца на голову и верхнюю часть тела мыши и крепко возьмитесь за тазовый пояс между недоминирующим большим и указательным пальцами. Следите за тем, чтобы ладонь была сложена, упираясь в голову мыши. Подвздошный гребень мыши должен быть пальпируемым и располагаться в центре дистальной фаланги каждого пальца (рис. 1A, B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удерживающие средства от рук или бумажного полотенца не должны ухудшать дыхание.
   3. Аккуратно вращайте основание хвоста, чтобы обеспечить правильное выравнивание позвоночника. Таз мыши должен быть квадратным, таким, чтобы позвоночные отростки поясничного отдела позвоночника располагались перпендикулярно рабочей поверхности.
   4. Промокните тыльную поясничную область мыши с помощью 70% спиртовой салфетки.
   5. Разделите волосы на расстоянии ~2-6 мм краниально к гребню подвздошной кости, чтобы помочь визуализировать место инъекции.
   6. Нащупайте межпозвоночное пространство L4-L5 или L5-L6, ~2-6 мм краниально от гребня подвздошной кости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точное расстояние зависит от размера и возраста мыши.
3. Инъекция
   1. Доминирующей рукой удерживайте центр микролитрового шприца и расположите его перпендикулярно позвоночнику мыши в межпозвоночном пространстве L4-L5 или L5-L6. Убедитесь, что поршень шприца можно нажать указательным пальцем без чрезмерного движения руки. Скосом иглы обращенной к голове мыши прокалывают кожу над межпозвоночным пространством.
   2. Когда на кончике иглы прощупываются края кости вокруг межпозвонкового пространства, уменьшите угол наклона шприца до 30-45 градусов (рисунок 1А).
   3. Игла должна проскальзывать в межпозвоночное пространство, вызывая резкий щелчок хвостом, и должна быть плотно зажата между позвонками.
   4. Стараясь не сместить шприц, нажимайте на поршень равномерно, чтобы раствор подавался в течение 10 секунд.
   5. Удерживайте шприц на месте в течение 15-30 секунд после полного нажатия на поршень, чтобы обеспечить рассеивание раствора и предотвратить обратный поток.
   6. Плавно и медленно извлекайте шприц из мыши под тем же углом входа 30-45 градусов. Когда игла будет извлечена, поверните шприц, чтобы предотвратить обратный поток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте осторожность, чтобы не продвигать иглу при вращении шприца, так как это может привести к физическому повреждению спинного мозга.
   7. Освободите мышь от ограничителя и верните ее в домашнюю клетку.
   8. Наблюдайте за мышью после инъекции на предмет аномальной способности передвижения, двигательных нарушений, нарушений дыхания и координации. Смотрите обсуждение для получения дополнительной информации о побочных реакциях.
   9. Очищайте оборудование, следуя рекомендациям производителя. Для многократных инъекций рекомендуются разные шприцы для каждого вектора генной терапии и контрольного раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Съемные иглы можно чистить, стерилизовать и использовать повторно несколько раз; Однако тупые иглы использовать не стоит, так как они могут навредить животному и увеличить вероятность пропущенных уколов. Тупая игла не проколет кожу легко, и от нее следует отказаться соответствующим образом. Если количество шприцев ограничено, рекомендуется завершить все инъекции носителя до того, как перейти к вектору генной терапии, и ввести наименьшую дозу генной терапии перед введением более высоких доз.
   10. Следуйте рекомендациям учреждения по стерилизации оборудования между животными.

Рисунок 1: Схема расположения пальцев и шприца для интратекальной инъекции в поясничном отделе позвоночника у мышей и крыс. (A) Вид сбоку мыши >P21, показывающий размещение иглы и изменение угла наклона шприца во время инъекции в поясничный отдел IT. Пунктирный красный овал указывает на расположение пальца над подвздошным гребнем мыши. Увеличенный вид позвоночника показывает интратекальное пространство (синий) с приблизительным расположением иглы (зеленая стрелка) и спинной мозг (розовый). Дорсальный вид (B) мыши >P21, (C) мыши D) крысы >P21, с опорными точками для размещения иглы (зеленый круг), тазового пояса (пунктирный желтый овал) и размещения пальцев (пунктирный красный овал). Место разреза и ретракторы также изображены на рисунке (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

2. Поясничная IT-инъекция мышам и крысам

Несмотря на то, что многие факторы могут влиять на трансдукцию вектора генной терапии, гистологическое окрашивание тканей остается наиболее точным методом определения успешности интратекальных инъекций поясничного отдела позвоночника (IT). Широкое и равномерное распределение вектора генной терапии в центральной нервной системе (ЦНС) после инъекции свидетельствует об успешной процедуре. На рисунке 2C представлена успешная инъекция самокомплементарной AAV9-опосредованной генной терапии, стимулирующей слабую повсеместную экспрессию трансгена под промотором JeT в дозе 1,3 × 10¹¹ vg/мышь у неонатальных мышей (P1) через 4 месяца после инъекции. Анализ РНК с использованием зонда, нацеленного на трансген, доставляемый генной терапией, выявляет широкое распространение в поясничном отделе спинного мозга, шейном отделе спинного мозга и головном мозге. В раздел включены разделы печени и сердца, чтобы подчеркнуть, что даже при прямом введении спинномозговой жидкости (СМЖ) вектор генной терапии все еще может быть распределен по периферическим тканям.

Рисунок 2: Окрашенные 5-микронные участки ткани ЦНС и периферической ткани мыши через 4 месяца после инъекции в P1. Красное окрашивание указывает на экспрессию трансгена с помощью РНК-скопа, а синее контрокрашивание ядер осуществляется с помощью гематоксилина. (А) Инъекция с буфером для контрольной состава. (B) Неудачная внутрипаренхиматозная инъекция вектором AAV9 (scAAV9_JeT-hDDX3Xopt-SpA). (C) Успешная инъекция ИТ-инъекции в поясничный отдел позвоночника с помощью вектора AAV9 (scAAV9_JeT-hDDX3Xopt-SpA). Вектор генной терапии, используемый в (B) и (C), вводили в трансляционно значимой дозе 1,3E11 vg/мышь. Масштабная линейка: верхняя панель (5 мм); нижняя панель (1 мм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Концентрированная экспрессия в поясничном отделе спинного мозга в сочетании с отсутствием экспрессии в головном мозге, как показано на рисунке 2B, может указывать на интрапаренхиматозную инъекцию спинного мозга и должна рассматриваться как неудачная инъекция. Это происходит, когда игла вводится слишком глубоко в позвоночный столб, мимо интратекального пространства и в спинной мозг. Кроме того, очень низкая экспрессия или ее отсутствие в спинном и головном мозге (не показано) также следует рассматривать как неудачную нецелевую инъекцию, предполагая, что вектор и доза используются там, где ожидается широкое распределение ЦНС. Это может быть связано с тем, что игла вводится недостаточно далеко или не расположена латерально к средней линии.

Паттерны экспрессии, наблюдаемые при успешных инъекциях, могут различаться в зависимости от следующих восьми факторов: (1) возраст на момент инъекции, (2) ранее существовавший иммунитет, (3) скорость инфузии, (4) вектор генной терапии, (5) доза генной терапии, (6) белки клеточной поверхности, (7) тропизм и (8) если применимо, подходящий выбор промотора для^{стимулирования экспрессии} трансгена.. В то время как паттерны экспрессии могут различаться, широкое, равномерное, широко распространенное распределение будет универсальным до тех пор, пока доза достаточно высока с эффективным вектором, таким как AAV9.

Основными ограничениями использования гистологического анализа для подтверждения успешности инъекции ИТ в поясничном отделе являются длительное время ожидания — ожидание до конца исследования, после проведения вскрытия и сбора тканей — и обширные ресурсы, необходимые для обработки тканей всех мышей в крупном исследовании генной терапии. К сожалению, наш опыт показывает, что немедленные и прямые признаки положительной или отрицательной инъекции могут быть ненадежными; Тем не менее, рефлекс щелчка хвостом при входе иглы в интратекальное пространство является хорошим индикатором успешного позиционирования в режиме реального времени и, вероятно, указывает на успешную инъекцию. Не путайте подергивание, когда игла прокалывает кожу у мыши/крысы без анестезии с реакцией хвоста на попадание иглы во внутрибольничное пространство. Использование фармакологических средств, таких как NMDA, вещество Р и лидокаин, как во время обучения, так и в смеси с экспериментальным раствором для инъекций, как сообщается, обеспечивает более непосредственное указание на успех инъекции ^9,11,24. Если речь идет об этих препаратах, важно оценить их совместимость с вектором генной терапии.

Инъекция поясничного отдела IT – это быстрая и малоинвазивная процедура, которая надежно доставляет вектор генной терапии в спинномозговую жидкость для лечения заболеваний ЦНС ^5,6. Процедура имеет трансляционное значение, и в описанном здесь протоколе подробно описано, как выполнять этот путь введения у мышей и крыс всех возрастов, от новорожденных до взрослых. Важно определить этот протокол для мышей и крыс всех возрастов, а также предоставить вспомогательные видеоматериалы, чтобы помочь исследователям во внедрении этого метода для введения генной терапии. Опыт нашей лаборатории показывает, что этот протокол может быть последовательно реализован для нескольких пользователей и исследований с течением времени 18,25,26,27,28,29,30.

Существуют важные различия при выполнении инъекции поясничного отдела IT у молодых мышей/крыс по сравнению со старыми мышами/крысами, в первую очередь в угле, под которым игла вводится в позвоночник, и рекомендуемом объеме, который вводится. Зарегистрированные объемы инъекций ИТ в поясничный отдел значительно варьируются в разных исследованиях и у разных видов³¹. Учет объема инъекции важен для того, чтобы избежать длительного повышения внутричерепного давления (ВЧД), которое может нарушить поток ликвора и мозговой крови, вызвать дискомфорт и привести к хроническим неврологическим осложнениям, включая гидроцефалию, ишемию, клеточное повреждение и смерть^32,33. ВЧД определяется объемом ликвора, мозговой крови и ткани ЦНС, которые не могут быть напрямую связаны с массой тела. При нормальном функционировании ВЧД автоматически регулируется многими факторами, включая объем ликвора, объем мозговой крови, дыхание, положение тела, скорость производства ликвора и скорость оттока ликвора в кровь^33,34. Таким образом, объемы инъекций ИТ должны определяться на основе свойств спинномозговой жидкости (Таблица 1), а не массы тела 25,27,28,30. Жирным шрифтом выделены рекомендуемые объемы для введения в каждом возрасте у каждого вида.

Таблица 1: Сводные данные об объемах инъекций ИТ в поясничный отдел позвоночника мышам и крысам в разном возрасте. Рекомендуется использовать жирные значения, которые были доставлены в целости и сохранности. Максимально возможные объемы формально не оценивались. Дополнительная информация об известных параметрах спинномозговой жидкости - общем объеме, скорости производства, обороте и внутричерепном давлении - у мышей и крыс включена для справки.

В этой области не хватает знаний о верхнем пороге для разовых объемов болюсных ИТ-инъекций. У взрослых людей, крыс и мышей, у которых известен объем СМЖ, увеличение общего объема СМЖ на 30%, по-видимому, не вызывает хронических травм или заболеваний 31,33,35,36. Отсутствие известных объемов спинномозговой жидкости у ювенильных или неонатальных мышей делает невозможной подобную экстраполяцию. Некоторые группы начинают изучать объем и продукцию спинномозговой жидкости у молодых животных³⁷. До тех пор, пока не будут проведены дополнительные исследования в этих областях, объем инъекций будет по-прежнему зависеть от значений, сообщаемых исследователями.

У мышей и крыс, особенно при лечении в более молодом возрасте или при больших объемах инъекций, может наблюдаться напряжение мышц, разгибание конечностей, учащенное дыхание или временный паралич задних конечностей, который должен пройти сам по себе в течение нескольких минут. В крайних случаях острое повышение ВЧД может вызвать сердечно-сосудистые и дыхательные аномалии, которые могут быть смертельно опасными^32,33. Если какие-либо постпроцедурные аномалии сохраняются через 24 ч, мышей/крыс следует удалить из исследования и гуманно усыпить. Стойкий паралич задних конечностей может возникнуть, если игла введена слишком далеко, воздействуя на спинной мозг. Это может быть связано с распространенной ошибкой при выполнении инъекции поясничного отдела IT: движение шприца после взмаха хвостом при нажатии на поршень. Следует избегать движений шприцем и иглой. Если с помощью первого прокола невозможно определить правильное положение, можно предпринять вторую попытку в том же месте. Если вторая попытка также не увенчалась успехом, попробуйте изменить положение иглы, чтобы нацелиться на следующее межпозвоночное пространство. Обратите внимание, что множественные уколы иглой могут привести к утечке последующей успешной инъекции.

Чтобы стать опытным в инъекциях ИТ для поясничного отдела, может потребоваться время. Чтобы практиковать инъекции в качестве терминальной процедуры, следуйте приведенному выше протоколу с использованием одобренного раствора красителя, такого как синий Эванса или зеленый краситель Маккормика с концентрацией 0,2 микрона (рис. 3), или с помощью фармакологических средств, рассмотренных в разделе «Репрезентативные результаты». Использование красителя рекомендуется для устранения неполадок и освоения инъекции, потому что в течение 1 минуты легко определить, была ли инъекция успешной или неудачной. Практика с красителем предназначена только для процедур, не связанных с выживанием, так как у животных может развиться реакция на краситель при непосредственном введении в ЦНС. Эта реакция может произойти в течение минуты после успешной инъекции и характеризуется быстрым зудом и извивающимися движениями. Животные должны быть немедленно усыплены, как только будет замечена такая реакция, чтобы свести к минимуму дискомфорт. После успешной практики инъекции красителя краситель останется локализованным в позвоночнике (без красителя в близлежащих периферических тканях) и будет двигаться вверх по позвоночному столбу к мозжечку, головному мозгу и обонятельным луковицам. В P1 кожа достаточно прозрачна, чтобы можно было увидеть, как краситель движется вниз по позвоночному столбу в хвосте. Если краситель не достигает мозга в течение нескольких минут, инъекция не удается.

Рисунок 3: Зеленый краситель Маккормика в мозге после успешной практики инъекций в поясничный отдел IT. Все мозги получены от мышей P21, которым ввели краситель в объеме 5 мкл, и показаны в вентральном виде. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Для получения дополнительной информации о соответствующих параметрах, связанных с дизайном доклинических испытаний, таких как титр вируса и дозы, см. ранее опубликованные обзоры ^3,6,31.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Мы хотели бы поблагодарить центральное предприятие по производству вирусного вектора AAV Юго-западного университета Техаса за производство вектора AAV9 и Юхуи Ху, научного сотрудника лаборатории Грея, за обработку и окрашивание ткани, представленной на рисунке 2.