Выделение проточной брыжеечной лимфы у мышей для количественной оценки in vivo кинетики поглощения липидов с пищей и секреции хиломикрона

Настоящий протокол описывает подробный хирургический протокол для выделения проточной кишечной лимфы в ответ на интрадуоденальные инфузии питательных веществ у мышей. Это позволяет физиологически определять общую кишечную абсорбцию липидов, а также синтез и секрецию хиломикрона в ответ на различные экспериментальные питательные вещества.

Кишечные липопротеины, особенно богатые триглицеридами хиломикроны, являются основной движущей силой обмена веществ, воспаления и сердечно-сосудистых заболеваний. Однако изолировать кишечные липопротеины очень сложно in vivo, потому что они сначала секретируются из тонкой кишки в брыжеечные лимфатические системы. Лимфа, содержащая хиломикрон, затем впадает в подключичную вену из грудного протока, доставляя компоненты пищи в сердце, легкие и, в конечном итоге, во все кровообращение тела. Выделение наивных хиломикронов из крови невозможно, так как триглицерид хиломикрона подвергается гидролизу сразу при взаимодействии с липопротеинлипазой и другими рецепторами липопротеидов в кровообращении. Таким образом, оригинальная 2-дневная процедура лимфатического свища, описанная Bollman et al. на крысах, исторически использовалась для выделения свежей брыжеечной лимфы до ее попадания в грудную вену. Этот протокол был усовершенствован и профессионализирован лабораторией Патрика Цо в течение последних 45 лет, что позволяет анализировать эти критические липопротеины и выделения из кишечника. Процедура лимфатической фистулы Цо теперь обновлена и впервые представлена здесь визуально. Эта пересмотренная процедура представляет собой однодневную хирургическую технику для установки трубки для питания двенадцатиперстной кишки, канюлирования брыжеечного лимфатического протока и сбора лимфы после еды у мышей, находящихся в сознании. Основные преимущества этих новых методов включают способность воспроизводимо собирать лимфу у мышей (что использует возможности генетических моделей мышей); сокращение времени анестезии мышей при имплантации дуоденальной инфузионной трубки и лимфатической канюли; возможность непрерывного отбора проб лимфы на протяжении всего периода кормления и после приема пищи; возможность количественно измерять гормоны и цитокины перед их разведением и ферментативным гидролизом в крови; и способность собирать большое количество лимфы для выделения кишечных липопротеинов. Этот метод является мощным инструментом для прямого и количественного измерения усвоения питательных веществ с пищей, синтеза липопротеинов в кишечнике и секреции хиломикронов.

Физиологическое значение брыжеечной лимфатической системы
Брыжеечные лимфатические сосуды были описаны в той или иной форме с ~ 300 г. до н.э., когда Герофил описал печеночную портальную систему и все «абсорбционные вены в кишечнике»1,2,3,4,5. В течение более 1,700 лет после этого первоначального описания определяющей характеристикой кишечной лимфы было присутствие молочной жидкости в брыжеечной лимфе вскоре после еды³. В настоящее время известно, что молочная, хиломикронсодержащая лимфа («хиловая» лимфа) не стекает в воротную вену и печень, а вместо этого проходит через цистерну хили в грудной проток и, в конечном итоге, присоединяется к крови в левой подключичной вене⁶. Из-за такого анатомического расположения хилезная лимфа сначала проходит через сердце и легкие, а затем циркулирует по остальной части тела. Это означает, что сердце и легкие получают «первый проход» при выделении в брыжеечную лимфу⁷.

Основная роль брыжеечных лимфатических узлов заключается в том, что они транспортируют пищевые липиды из тонкой кишки ^8,9,10. Анатомически хиломикроны, иммунные клетки кишечника 11,12,13,14, гормоны кишечника 15,16,17,18, антигены ^19,20,21, липофильные соединения ^22,23 , и избыточная жидкость попадает в млечные клетки, лежащие в основе базальной мембраны энтероцитов, а затем концентрируется через лимфатические капилляры в брыжеечные лимфатические узлы. Вероятно, существует много неизвестных брыжеечных лимфатических компонентов, включая метаболиты, антигены, загрязнители окружающей среды, питательные вещества и сигнальные молекулы.

Компоненты брыжеечной лимфы систематически не идентифицированы, в основном из-за трудности выделения брыжеечной лимфы. Доступ к брыжеечной лимфе всегда был серьезной проблемой, потому что лимфатические протоки бесцветны, и, за исключением жирной пищи, когда они становятся хилезными и молочными, брыжеечные лимфатические жидкости содержат бесцветную лимфатическую жидкость 6,8,9,10.

Современные и распространенные методы выделения кишечной лимфы
Доступ к брыжеечной лимфе у человека невозможен (за исключением редких и экстремальных случаев, когда произошла серьезная травма желудочно-кишечного тракта)²⁴. Сбор лимфы in vivo является хирургически сложным и требовательным. Оригинальная 2-дневная процедура лечения лимфатического свища была описана Bollman et al.25 и была усовершенствована и профессионализирована лабораторией Патрика Цо в течение последних ^{45 лет 26,27}. Процедура лимфатической фистулы позволяет исследователям собирать текущую лимфу у животных, находящихся в сознании, в течение 6-часового периода инфузии липидов двенадцатиперстной кишки.

Модель лимфатической фистулы в основном использовалась на крысах для измерения скорости лимфотока, выхода триглицеридов и холестерина (или других соединений, инфузионных в двенадцатиперстной кишке), состава хиломикронов и концентраций кишечных гормонов. В меньшей степени этот метод также может быть использован на мышах, хотя хирургическая выживаемость и объем лимфы страдают. Из-за трудностей с видением брыжеечных лимфатических протоков исторические методы включали канюлирование брыжеечной лимфы у более крупных животных, таких как мини-свиньи²⁸, овцы²⁹, свиньи³⁰, собаки³¹ и крысы¹⁷. Работа с этими более крупными моделями является ресурсоемкой и не позволяет проводить исследования в нокаутных или нокаутных моделях.

Использовались и альтернативные подходы. Хиломикроны могут быть выделены из крови в постпрандиальном состоянии (хотя они будут частично гидролизованы липопротеинлипазой плазмы)^32,33,34,35. Грудной проток также может быть канюлирован, хотя собранная там лимфа содержит примесь брыжеечной лимфы и внекишечного лимфодренажа^26,36. In vitro клетки Caco-2 секретируют хиломикроноподобную частицу в ответ на обработку жирными кислотами, и эти клетки могут культивироваться совместно с соответствующими лимфатическими эндотелиальными или сосудистыми клетками^37,38. Было показано, что культуры кишечных органоидов человека и мыши обрабатывают апикальные липиды и секретируют хиломикроны 39,40,41,42. Эти модели очень выгодны и позволяют механистически понять физиологию тонкого кишечника, но они не могут воспроизвести сложность, физико-химические градиенты или динамический лимфоток брыжеечных лимфатиков in situ.

Преимущества 1-дневной модели лимфатического свища мыши, представленной здесь
Что касается этих других методов выделения кишечных липопротеинов, метод лимфатических свищей Tso Lab традиционно считается золотым стандартом для измерения поглощения пищевых питательных веществ в брыжеечную лимфу. Преимущество этого метода in vivo заключается в том, что он фиксирует ключевые физиологические аспекты поглощения липидов с пищей - динамическое появление соединений в течение периода абсорбции, что требует повторного отбора проб текущей брыжеечной лимфы у живых животных с питательными веществами двенадцатиперстной кишки. Этот хирургический метод также измеряет кишечные гормоны и цитокины непосредственно в их физиологическом отсеке, а не в крови, где они разбавляются и ферментативно разлагаются^17,43.

Если экспериментальный вопрос требует понимания динамики секреции липидов или динамического поглощения и метаболизма любого гидрофобного соединения или лекарственного средства желудочно-кишечного тракта, то этот метод не только уместен, но и является единственным подходом, который интерполирует движение просветного содержимого от проксимального к дистальному отделу кишечника (от желудка к толстой кишке) и от апикальной к базолатеральной поверхности (просветное содержимое через энтероциты к млечным и портальным кровообращениям). Поскольку в этом методе используется просветная доставка питательных веществ через интрадуоденальный катетер, а также поскольку текущая брыжеечная лимфа отводится и собирается, весь абсорбционный аппарат находится под экспериментальным контролем и может быть использован для качественной оценки профилей абсорбции в тонком кишечнике.

Здесь впервые визуально представлено крупное обновление модели лимфатического свища Tso Lab, которое (1) сокращает время эксперимента до 1 дня хирургической имплантации и периода экспериментального сбора; (2) улучшает выживаемость мышей и благополучие животных; и (3) увеличивает воспроизводимость подхода у мышей, чтобы использовать возможности генетических моделей мышей. Этот метод следует считать золотым стандартом для всех экспериментальных вопросов кишечной секреции, липопротеинов или диетической абсорбции липидов и является лучшим методом для высокоточного определения кинетики абсорбции липидов и хиломикронов.

Все хирургические процедуры были одобрены Комитетом по внутреннему уходу за животными и их использованию Университета Питтсбурга [Протокол # 20047008] и соответствуют Руководству NIH по уходу и использованию лабораторных животных. Для настоящего исследования использовались самцы мышей C57BL6/J в возрасте 8-14 недель. Мыши были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Все мыши были размещены в 12-часовом цикле свет/темнота с добровольным доступом к стандартному корму и воде.

1. Подготовка животных

1. В зависимости от плана эксперимента кормите мышей или позволяйте им голодать.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ночное голодание не требуется, если нет опасений по поводу различий в скорости опорожнения желудка.
2. Индуцируйте анестезию 5% изофлурановым газом и обеспечьте надлежащую анестезию путем защемления хвоста и пальца ног. После анестезии держите мышей в надлежащем анестезирующем состоянии с помощью 2-3% изофлурана и поместите их с помощью ленты на хирургическую платформу.
3. Держите мышей в тепле на подогретой хирургической платформе, в которой используется циркулирующая теплая вода (см. Таблицу материалов).

2. Хирургия и экспериментальный дизайн

1. Начните операцию с нанесения ветеринарной мази на глаза, бритья живота и нанесения антисептического хирургического скраба (см. Таблицу материалов) на место операции. Это стерилизует разрез и уменьшает образование воздушно-капельного меха во время разреза по средней линии.
2. Поддерживайте стерильную рабочую зону, используя стерильные инструменты, шторы и другое необходимое оборудование и расходные материалы.
3. Вводят первую дозу карпрофена (см. Таблицу материалов) для обезболивания (в/) в дозе 5 мг/кг.
4. Обхватите кожу пинцетом и сделайте разрез по средней линии живота маленькими ножницами. Разрежьте по направлению к грудине (ни в коем случае не выше) и срежьте до пахового жира. Затем разрежьте мышечный слой отдельно с помощью ножниц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизуйте все оборудование перед использованием.
5. С помощью ретрактора отодвиньте брюшные внутренности в сторону, пока не станет виден лимфатический проток.
6. Используя пропитанную солевым раствором ватную палочку (см. Таблицу материалов), переместите печень в верхнюю правую часть тела, а кишечник и желудок — слева от животного.
7. Растяните двенадцатиперстную кишку влево поперечно, чтобы обнажить верхнюю брыжеечную артерию и лимфатический проток кишечника.
8. Подготовьте трубку канюли длиной 30-40 см, вставив тупую иглу в трубку канюли (см. Таблицу материалов), и промойте небольшое количество гепарина (1000 Ед / л) через трубку с помощью шприца объемом 1 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лимфатическому потоку сила тяжести помогает стекать вниз и попадать в пробирки для сбора микроцентрифуг на льду. В зависимости от того, где ведро со льдом расположено рядом с хирургической установкой, может потребоваться регулировка длины трубки канюли.
9. Используйте ножницы, чтобы вырезать скос на кончике трубки канюли.
10. Сделайте неглубокий разрез ножницами радужной оболочки (см. Таблицу материалов) в лимфатическом протоке примерно в 5 мм от его появления в тонком кишечнике.
11. Удерживайте трубку канюли парой тонких щипцов и осторожно вставьте скос наконечника в воздуховод.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно не проталкивать канюлю слишком далеко в проток, потому что это может помешать лимфотоку, когда втянутые органы возвращаются в исходное положение.
12. Лимфатический проток слишком хрупок для манипуляций, связанных с завязыванием катетера швом. Вместо этого используйте каплю цианоакрилатного клея (см. Таблицу материалов), чтобы приклеить лимфатическую канюлю в брыжеечный лимфатический проток.
13. Проверьте наличие молочной, белой лимфы (если перед операцией использовался желудочный зонд с оливковым маслом) или прозрачной лимфы (если мыши голодали перед операцией), которая начинает немедленно течь через канюлю лимфатического свища.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что лимфатическая канюля успешно размещена и лимфа течет; Продолжайте установку интрадуоденальной канюли.
14. С помощью иглы 18 G проколите отверстие в пилорической области желудка позади пилорического сфинктера.
15. Вставьте инфузионную трубку двенадцатиперстной кишки (см. Таблицу материалов) через это отверстие в желудке примерно на 1-2 мм за пределы пилорического сфинктера в двенадцатиперстную кишку.
16. Закрепите пузыреобразной нитью с помощью шелкового шва 5-0 (см. Таблицу материалов) иглой к животу и запечатайте каплей цианоакрилатного клея для предотвращения протекания.
17. Начните внутридуоденальную инфузию 5% глюкозы-0,9% физиологического раствора со скоростью 0,3 мл / ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании мышей с небольшими отклонениями в массе тела, которые весят примерно 25 г (~ 8 недель), целесообразна инфузия глюкозы / физиологического раствора в дозе 0,3 мл / ч. Если мыши значительно крупнее, скорость инфузии должна быть скорректирована в сторону увеличения, чтобы учесть изменение массы тела и объема крови.
18. Замените органы в полости тела и зашите (5-0) мышечные и кожные ткани отдельно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лимфатическая канюля и интрадуоденальная питательная трубка экстериоризируются через один и тот же разрез. Нет прецедента разделения труб швом и нет предпочтения угла экстериоризации труб.
19. После операции, но до отмены анестетика, осторожно поместите мышей в ограничители Snuggle (см. Таблицу материалов), чтобы ограничить подвижность.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удерживающие устройства не позволяют мышам хватать или вращать головой, чтобы жевать швы и трубки.
20. Затем поместите мышей в прозрачную коробку из плексигласа на вращателе с мягким покачиванием и согрейте с помощью коммерчески доступной грелки для амфибий / рептилий с регулируемой температурой, прикрепленной к боковой стороне контейнера для содержания. Обеспечьте увлажнение также в виде стерильных емкостей для деионизированной воды по углам контейнера для содержания (см. Таблицу материалов).
21. За 30 минут до отмены изофлурана введите мышам вторую обезболивающую дозу (Бупренекс, 0,1 мг / кг, внутривенно).
22. В зависимости от эксперимента обеспечьте мышам непрерывную интрадуоденальную инфузию 5% глюкозы-0,9% физиологического раствора со скоростью 0,3 мл/ч в течение 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 5% раствор глюкозы-0,9% физиологического раствора готовят с использованием стерильного физиологического пакета (для использования человеком, pH 7,4) из аптеки и стерильного флакона для использования человеком с 50% декстрозой, следуя строгим рекомендациям по стерильности. Раствор должен быть свежим и выброшен, если истек срок годности, указанный на солевом пакете или флаконе с декстрозой.
23. Вводят мышам один из липидов, перечисленных в таблице 1 , в качестве экспериментального липида через интрадуоденальную канюлю (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех данных, показанных на рисунке 1, SMOFlipid (20% липидная инъекционная эмульсия, USP, см. Таблицу материалов) вводили внутридуоденально. Эта инфузия как до, так и после интрадуоденального липидного болюса заменяет потерянную жидкость, стекающую через лимфатический проток, и является абсолютным требованием. Теперь мыши готовы к введению экспериментальной дозы липидов.
24. Выполните классическую липидную инфузию болюсной липидной эмульсии объемом 0,3 мл (20% липидная инъекционная эмульсия SMOFlipid, USP) через инфузионную трубку для внутридуоденальной кишки (см. Таблицу материалов).
25. После болюсной инфузии интрадуоденальных липидов переключите инфузию обратно на 5% глюкозы-0,9% физиологического раствора при 0,3 мл / ч непрерывно до конца эксперимента.
26. Соберите образцы лимфы в предварительно взвешенные микроцентрифужные пробирки в течение 60 минут и держите лимфу на льду. Взвесьте трубки второй раз, чтобы установить вес лимфы, которая выделяется каждые 60 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидайте, что вы соберете примерно 50-300 мкл лимфы в час на мышь в течение ~ 6 ч после липидного болюса 0,3 мл.
27. Лимфа может течь до 6 часов после инфузии липидов. Через 6 часов усыпьте мышей с помощью изофлурана и вывиха шейки матки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хирург и/или лаборант должны присутствовать для наблюдения за животными на протяжении всего эксперимента. Во время наблюдения обратите внимание на сгустки в лимфатическом дренаже и изменения в поведении животных, которые указывают на боль / дистресс. Если лимфатический проток закупоривается в какой-либо момент во время эксперимента, эксперимент прекращают, а животное усыпляют. Технически животное может оставаться живым до 24 часов после операции (в соответствии с правилами операции по выживанию IACUC). Однако показатели выживаемости со временем снижаются, и 6 ч - это воспроизводимый период выживания, когда поглощение липидов все еще имитирует физиологию in vivo , и животное не борется с выживанием.
28. Выполните забор терминальной ткани после эвтаназии (шаг 3.1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разница в профилях поглощения липидов с пищей у мышей, которых держали в течение 6 или 24 часов после операции, была недавно протестирована⁴⁴. Мы обнаружили, что 24-часовая процедура снижает выживаемость животных и экскурсию пищевых липидов в лимфу. По этим причинам мы настоятельно рекомендуем 6-часовой подход. Эта обновленная хирургическая конструкция снижает ненужную гибель животных и вероятность страданий животных в послеоперационном периоде. Это поддерживает основную цель Американской ассоциации по аккредитации ухода за лабораторными животными, которая заключается в «замене, сокращении, уточнении» животных [ссылка PMID: 21595115].

3. Сбор просветного содержимого и ткани слизистой оболочки

1. В конце 6-часового периода инфузии липидов приносите мышей в жертву через изофлуран и вывих шейки матки. Обвяжите оба конца желудка, тонкой кишки и слепой кишки швами 5-0, чтобы избежать утечки просветного содержимого.
2. Соберите желудок, слепую кишку и толстую кишку и поместите каждый в стеклянную трубку объемом 15 мл. Разделите тонкую кишку на три или четыре сегмента и соберите содержимое просвета, промыв ткань в 2-3 мл холодного PBS после продольного разреза.
3. Удалите слизистую оболочку кишечника, содержащую эпителиальные клетки и связанную с ними собственную пластинку, из мышечного слоя, соскабливая каждый участок в 2-3 мл холодного PBS изогнутым пинцетом.
4. Поместите все ткани, изоляты просвета и слизистой оболочки, а также мышечный слой в стеклянные пробирки и добавьте 8 мл 2:1 об./об. CHCl₃:MeOH в каждую пробирку.
5. Определите радиоактивность и/или концентрацию липидов с помощью жидкостного сцинтилляционного подсчета и/или набора для анализа триглицеридов (см. Таблицу материалов) после экстракции^{Folch 45}.

4. Тонкослойная хроматография (ТСХ)

1. Экстрагируют общие липиды изолятов просвета и слизистой оболочки с помощью модифицированной экстракции по Фолчу⁴⁵.
2. Высушите экстрагированные липиды в растворителе под испарителем азота, а затем ресуспендируйте их в 2:1 об./об. CHCl₃:MeOH перед загрузкой на пластину из силикагеля TLC (см. Таблицу материалов).
3. Разделите липиды с помощью системы растворителей, состоящей из петролейного эфира, этилового эфира и ледяной уксусной кислоты (25:5:1 об./об./об.). Используйте пары йода для визуализации различных липидов, в том числе стандартов.
4. Соскребите пятна на пластине TLC, соответствующие моноглицериду / фосфолипиду, диглицеридам, жирным кислотам, триглицеридам и эфиру холестерина, в отдельные сцинтилляционные флаконы перед добавлением 4 мл сцинтилляционной жидкости (см. Таблицу материалов) для подсчета сцинтилляций.
5. Выразите данные либо в процентах от общей дозы болюсного липида, либо в виде доли от общего количества липидов, обнаруженных для каждого образца.

5. Выделение и характеристика хиломикронов

1. Перенесите объединенные образцы лимфы из 6-часового постлипидного болюса (этап 2.29) в ультрацентрифужные пробирки, смешанные с 0,9% NaCl (300-500 мкл), а затем тщательно наложите соответствующий объем 0,87% NaCl (300-500 мкл).
   1. Ультрацентрифугу (см. Таблицу материалов) с образцами при 110 000 x g при 4 °C в течение 16 ч. Соберите верхнюю фракцию, содержащую выделенные хиломикроны, и перенесите их в новую микроцентрифужную пробирку.
2. Определите концентрацию триглицеридов, холестерина и апоВ хиломикрона, выполнив следующие действия.
   1. Определите концентрацию триглицеридов и холестерина с помощью набора для анализа триглицеридов и холестерина (см. Таблицу материалов).
   2. Вкратце, инкубируйте 2 мкл образцов с 200 мкл ферментного реагента при 37 ° C в течение 5 мин в 96-луночном планшете. Считайте табличку с помощью планшетного считывателя с длиной волны 500 нм для триглицеридов и 600 нм для холестерина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для расчета концентраций использовались эталоны и бланки. Концентрации ApoB определяли с помощью набора ИФА Mouse ApoB (см. Таблицу материалов).
3. Определите размер частиц хиломикрона.
   1. Используйте свежие образцы хиломикрона с концентрацией триглицеридов около 40 мг/дл для визуализации ПЭМ. Вкратце, поместите 5-10 мкл каждого образца на сетку ПЭМ и высушите.
   2. Изучите сетку с помощью просвечивающего электронного микроскопа и сделайте снимки. Измерьте размеры частиц липопротеинов и проанализируйте их с помощью программного обеспечения ImageJ (см. Таблицу материалов).

На рисунке 2 показана секреция триглицеридов в брыжеечной лимфе и средняя скорость лимфотока у самых последних n = 17 мышей дикого типа (WT), которые подверглись однодневной процедуре лимфатической фистулы, описанной здесь. Как показано на рисунке 2А, концентрация триглицеридов в лимфе увеличивается в ответ на внутридуоденальный болюс 300 мкл SMOFLipid. Пиковая концентрация триглицеридов достигается через ~2-3 ч после болюса и неуклонно снижается в течение 6 ч (непосредственно перед эвтаназией). Параллельно с секрецией триглицеридов скорость лимфотока увеличивается с момента болюсной инфузии 0 до конца эксперимента (рис. 2B).

Эти результаты показывают, что хирургическая имплантация как брыжеечного лимфатического протока, так и интрадуоденальной канюли имела место и является репрезентативной для положительного контроля, с которым можно было бы сравнить другое лимфатическое содержимое (гормоны, пептиды, питательные вещества). Если концентрация триглицеридов в лимфе не меняется в ответ на болюсные внутридуоденальные липиды, это сигнализирует о том, что операция нанесла значительный ущерб тонкой кишке, так что способность всасывания липидов отсутствует, или, в ранее нефенотипированных генетических моделях, это говорит о том, что у мыши есть дефект всасывания липидов, который является физиологически значимым.

Рисунок 1: Предлагаемая временная шкала для модели мыши с лимфатическим свищом. Т-4, Т-3, Т-2: Двойная канюляция занимает примерно 2-4 часа с последующим помещением мышей в камеры восстановления. T-1: Как только мыши находятся в периоде восстановления, они получают непрерывную дуоденальную инфузию 5% глюкозы-0,9% физиологического раствора. T0: непрерывная интрадуоденальная инфузия переключается с 5% глюкозы-0,9% физиологического раствора на инфузию экспериментальных питательных веществ. T0-T6: Мыши получают непрерывную внутридуоденальную 5% глюкозу в физиологическом растворе или, в качестве альтернативы, непрерывные питательные вещества. Лимфа собирается ежечасно в этот период. Конечная точка: мышей усыпляют, и ткани могут быть собраны. Фигура была создана с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Концентрация и скорость потока триглицеридов брыжеечной лимфы. Мышам дикого типа была установлена интрадуоденальная питательная трубка и брыжеечная лимфатическая канюля. Мыши получали болюсную инфузию 300 мкл липидов. Лимфу собирали в течение 6 ч в ежечасных аликвотах и держали на льду. (A) Содержание триглицеридов в лимфе определяли химическим анализом в каждой часовой аликвоте лимфы. (B) Через 6 ч после болюсной инфузии лимфоток отображается в виде граммов лимфы, выделяемой в час. Баллы - это средства ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Таблица липидных инфузий.

Оригинальная 2-дневная процедура лимфатического свища была описана Bollman et al.25 и практиковалась лабораторией Патрика Цо в течение последних ^{45 лет 26,27}. Представленный здесь протокол является мощным дополнением к этому классическому методу золотого стандарта для выявления, количественной оценки и понимания уникальных хилезных выделений тонкой кишки, а также динамики in vivo усвоения питательных веществ и метаболизма, кишечных гормонов и кишечного иммунитета.

Преимущества этой модели включают (1) возможность непрерывного отбора проб брыжеечной лимфы в течение всего периода кормления и после приема пищи, а не статический отбор проб в один момент времени во время абсорбции, пищеварения или секреции; (2) измерение кишечных гормонов и цитокинов непосредственно в их физиологическом отделе, а не в крови, где они разбавляются и ферментативно разлагаются^17,44; (3) способность выделять, количественно определять и характеризовать липопротеины, секретируемые тонкой кишкой после приема липидной пищи, и отсутствие эндотелиальных липаз в брыжеечной лимфе, что сохраняет концентрацию триглицеридов хиломикрона и нативную структуру хиломикрона^46,47; (4) способность напрямую измерять скорость лимфотока, выход триглицеридов и холестерина (или других соединений, инфузиированных в двенадцатиперстную кишку), состав хиломикрона и концентрацию кишечных гормонов. Наконец, этот протокол позволяет собирать относительно большие количества >50 мкл лимфы каждый час в течение 6 часов. По мере того, как жидкость пополняется внутридуоденальным физиологическим раствором и инфузией глюкозы, модель лимфатического свища значительно улучшается по сравнению с другими методами отбора проб лимфы и приводит к проточным, а не статическим бассейнам брыжеечной лимфы. Поскольку объем является основным препятствием для липидомных, протеомных и метаболомных подходов, это является основным преимуществом.

Описанный здесь протокол 1-дневного лимфатического свища мыши имеет ряд преимуществ по сравнению с исходным протоколом лимфатической фистулы, включая снижение общего количества экспериментальных животных по сравнению с ранее описанными 2-дневными протоколами лимфатических свищей^26,27 из-за более высокой выживаемости после операции; сокращение общего времени эксперимента с 2 суток до одного дня; и, наконец, сокращение периода восстановления для мышей с ночи (>18 ч), когда может возникнуть прорывная боль или плохие послеоперационные исходы, до более управляемого ~ 6 ч послеоперационного периода.

Особенностью этого 1-дневного протокола является сосредоточение внимания на гуманных соображениях и конечных точках. Они должны иметь наивысший приоритет: (1) животные должны получать интрадуоденальные или внутривенные заместительные жидкости; (2) они должны быть теплыми и безболезненными, насколько это возможно (с послеоперационным бупренексом и / или карпрофеном, в зависимости от дизайна эксперимента и необходимости избегать противовоспалительных эффектов); (3) кровотечение, дрожь, диарея или признаки дистресса — все это веские причины для гуманной конечной точки. Согласно строгим рекомендациям IACUC, изофлуран с последующим вывихом шейки матки является хорошей конечной точкой. Хирургическая выживаемость составляет ~ 70% в течение одного дня (по сравнению с ~ 40% для первоначальной 2-дневной операции), но исследователи не должны колебаться, чтобы закончить эксперимент при признаке бедствия. Это следует учитывать при планировании численности животных.

С точки зрения устранения неполадок в этой технике, успешное размещение лимфатической канюли является основным узким местом в этой хирургической процедуре. Во время тренировки операции полезно протравить мышь 0,3 мл оливкового масла примерно за 2 часа до операции. Это вызовет секрецию хиломикронов в брыжеечный лимфатический проток, сделав его «молочным» и более заметным. Метиленовый синий также можно использовать, но он часто менее очевиден, чем млечный лимфатический проток. Если после установки лимфатической канюли и ее установки с помощью клея брыжеечная лимфа успешно течет через канюлю в сборный сосуд, то можно приступать к установке дуоденальной инфузионной трубки. Иногда лимфа может не течь непрерывно, но может снова начать течь, когда животное помещается на вращающийся стол. Важно следить за сгустками в лимфатических трубках. Их следует массировать из трубок, чтобы предотвратить обратное давление на лимфатический проток.

Помимо секреции триглицеридов и скорости лимфотока, этот метод может быть использован для определения следующих кинетики поглощения липидов и характеристик хиломикрона:

Секреция хиломикрона^45,48,49
Сразу после приема пищи, содержащей жир, наблюдается временное повышение уровня циркулирующего триглицерида в плазме. Поскольку триглицериды по своей природе гидрофобны, они должны быть сначала эмульгированы, чтобы быть растворимыми в крови⁵⁰. Энтероциты тонкой кишки выполняют эту роль и упаковывают диетические триглицериды в частицы эмульсии хиломикрона⁵¹. Хиломикроны содержат холестерин и диетические триглицериды в своем ядре, окруженные фосфолипидами и аполипопротеинами, включая apoB-48, apoA-I, apoA-IV и apoC-III ^52,53,54,55. ApoB-48 является важным структурным белком, а другие аполипопротеины выполняют различные функции, необходимые для метаболизма хиломикронов и выведения из крови. Для определения ключевых характеристик хиломикронов, включая содержание в них триглицеридов и аполипопротеинов, следует использовать показанную здесь методику лимфатического свища за 1 день. Скорость секреции хиломикрона - это процент инфузионного 3-Н-триглицерида, который секретируется в лимфу и измеряется сцинтилляцией путем подсчета ежечасных образцов лимфы. Это можно сочетать с подробной характеристикой хиломикрона 48,49,56,57,58. Почасовые пробы лимфы можно комбинировать или хранить отдельно. Лимфу переносят в ультрацентрифужные пробирки, смешивают с 0,9% NaCl, а затем тщательно накладывают 300-500 мкл 0,87% NaCl. Затем образцы ультрацентрифугируют при 110 000 x g при 4 °C в течение 16 часов. Верхние фракции, содержащие изолированные хиломикроны, собирают и проверяют на концентрацию триглицеридов с помощью набора для анализа триглицеридов. Вкратце, 2 мкл хиломикрона (разведение 1:10) инкубируют с 200 мкл ферментного реагента при комнатной температуре в течение 10 мин в 96-луночном планшете. Пластина считывается планшетным считывателем на длине волны 500 нм, а стандарты и бланки используются для расчета концентраций триглицеридов. Затем размер хиломикрона можно определить с помощью отрицательного окрашивания и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ)^14,29. Триглицериды и холестерин могут быть количественно определены с помощью химического анализа и содержания аполипопротеинов (apoB-48, A-I, C-II, C-III) с помощью наборов ИФА или вестерн-блоттинга.

Определение первичного места всасывания липидов ^48,59
Изолируя просветные и эпителиальные клеточные компартменты двенадцатиперстной кишки, тощей кишки и подвздошной кишки через 6 ч после инфузии 3-Н-триглицерида или смешанной пищи с радиоактивной меткой, содержимое извлекают по Фолчу, чтобы определить, сколько из ³Н-триглицерида абсорбируется через мембрану эпителиальных клеток (нормально) или задерживается в просвете (аномально) по длине тонкой кишки⁴⁸ . Эти исследования особенно эффективны, если существуют потенциальные различия в подвижности желудочно-кишечного тракта 60,61,62, если существует гипотеза относительно желчных кислот (высокоактивных во время всасывания липидов и сами реабсорбируются в подвздошной кишке)63,64,65,66, или если есть опасения^, что питательные вещества всасываются в неправильном анатомическом месте (подвздошной или даже толстой кишке)⁶⁷ ,^68,69,70.

Идентификация механизмов транспортировки 3-Н-триглицеридов в абсорбирующие эпителиальные клетки⁴⁸
Это выполняется путем расчета процента 3-Н-триглицерида, гидролизованного до 3-Н-свободной жирной кислоты в просвете кишечника, всасываемого в слизистую оболочку и переэтерифицируемого во внутриклеточный ^{3-Н-триглицерид}перед секрецией в виде хиломикронов. Это мощный маркер дефектов абсорбции/секреции, поскольку его можно проследить, чтобы показать движение диетического триглицерида в продукты его распада и последующую упаковку в хиломикроны. Экспрессия мРНК механизма абсорбции жирных кислот (CD36, FABP, ACSL), пути реэтерификации (MGAT, DGAT, MTTP, apoB) и аполипопротеинов (apoC-III, B-48, C-II, A-I, A-IV) может быть дополнительно количественно определена с помощью ОТ-ПЦР.

Будущие применения этого метода ограничены только интересом к перекрестным помехам между кишечником и органами, метаболизму, иммунитету, усвоению питательных веществ, загрязнителям окружающей среды или любым другим заболеваниям, играющим роль в системе желудочно-кишечного тракта. Вполне вероятно, что многие убедительные эксперименты и гипотезы зашли в тупик из-за трудности доступа к критической брыжеечной лимфатической системе, и цель этого визуализированного протокола состоит в том, чтобы сделать этот метод более доступным. Выделение хиломикронов и брыжеечной лимфы, в которой они изначально находятся, является важной частью понимания метаболизма всего тела; 1-дневная модель лимфатического свища мыши является мощной физиологической моделью для изучения этих событий.

Авторам раскрывать нечего.

Мы чрезвычайно благодарны Фонду муковисцидоза (Pilot and Feasibility Award 1810, ABK), Фонду Райнина (Synergy Award, PI GJ Randolph и Co-I ABK) и Национальным институтам здравоохранения (R01DK118239, R03DK116011 ABK) за их поддержку этих исследований.