Динамический мониторинг сероконверсии с использованием мультианалитного иммуногранулного анализа на Covid-19

В данной статье описан удобный метод мониторинга динамических изменений титров антител для двух изотипов иммуноглобулина одновременно (IgA, IgM или IgG) в результате иммунного ответа на инфекцию SARS-CoV-2 или вакцинацию. Эта «Мультианалитическая панель иммунного ответа Covid-19» использует три косвенных иммуноанализа, построенных на закодированных микросферах, которые считываются с помощью мультиплексного считывателя на основе потока с возможностью «двухканального».

Мультиплексные технологии для совместного опроса нескольких биомаркеров существуют уже несколько десятилетий; однако методы оценки нескольких эпитопов на одном и том же анализируемом веществе остаются ограниченными. В этом отчете описывается разработка и оптимизация мультиплексированного иммунобусирного анализа для серологического тестирования общих изотипов иммуноглобулинов (например, IgA, IgM и IgG), связанных с иммунным ответом на инфекцию SARS-CoV-2 или вакцинацию. Анализы были выполнены с использованием проточного мультиплексного флуоресцентного считывателя с двухканальной функцией. Оптимизация была сосредоточена на времени захвата анализируемого вещества, концентрации антител обнаружения и времени инкубации антител обнаружения. Эксплуатационные характеристики аналитического анализа (например, диапазон анализа (включая нижний и верхний пределы квантования); а также внутри- и межпробирная точность) были установлены для комбинации серотипов IgG/IgM или IgA/IgM в тандеме с использованием двухканального режима. Время захвата аналита 30 мин для IgG, 60 мин для IgM и 120 мин для IgA было подходящим для большинства применений, обеспечивая баланс производительности анализа и пропускной способности. Наблюдалось оптимальное обнаружение инкубаций антител при 4 мкг/мл в течение 30 мин и рекомендуется для общих применений, учитывая общую отличную точность (процентный коэффициент дисперсии (%CV) ≤ 20%) и наблюдаемые значения чувствительности. Динамический диапазон для изотипа IgG охватывал несколько порядков величины для каждого анализа (Spike S1, Nucleocapsid и Мембранные гликопротеины), что поддерживает надежные оценки титра при коэффициенте разбавления 1:500 для клинических применений. Наконец, оптимизированный протокол был применен для мониторинга сероконверсии Spike S1 для субъектов (n = 4), которые завершили схему вакцинации против SARS-CoV-2. В этой когорте наблюдалось, что уровни Spike S1 IgG достигают максимальных титров через 14 дней после введения второй дозы при гораздо более высокой (~ 40-кратной) интенсивности сигнала, чем изотипы IgM или IgA. Интересно, что мы наблюдали очень изменчивые скорости распада титра Spike S1 IgG, которые в значительной степени зависели от субъекта, что станет темой будущих исследований.

Одновременное измерение нескольких связанных с заболеванием биомаркеров в биологических образцах позволяет описательно и прогнозно понять патологические процессы. В то время как обычные иммунологические процедуры с одним анализом, такие как иммуноферментные анализы (ИФА), были краеугольным камнем количественного анализа как в клинических, так и в исследовательских условиях, эти методы могут иметь существенные ограничения в отношении пропускной способности, количества образцов, необходимых для каждого измерения, и экономической эффективности, которые значительно ограничивают изучение нескольких биологических элементов, которые часто переплетаются на протяжении всего течения заболевания^1. . Технология мультиплексирования на основе микросферы стала незаменимой платформой как для диагностических, так и для исследовательских учреждений благодаря своей способности комбинировать анализы для повышения пропускной способности лаборатории, смягчения дефицита образцов и сокращения повторяющихся испытаний для максимальной экономии средств 1,2,3,4. В последнее время было введено дальнейшее увеличение этой мультиплексирующей мощности с помощью инструментов, обладающих возможностями двойного репортера. Функция двойного репортера реализует два флуоресцентных канала для обнаружения, обеспечивая еще одно измерение мультиплексирования, позволяя обнаруживать несколько эпитопов на одном анализируемом объекте.

Коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) является возбудителем, ответственным за текущую пандемию коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19)⁵. В то время как тестирование ОТ-ПЦР имеет решающее значение для подтверждения инфекции в начале течения заболевания, серологические исследования титров антител оказались необходимыми для точной и полной критики людей в отношении предыдущего воздействия или выздоровления; ответные меры на иммунизацию; и/или оценка эффективности вакцинации против Covid-19 ^6,7.

В этом отчете описываются методы измерения сероконверсии для нескольких вирусных антигенов SARS-CoV-2, которые используют систему двойной отчетности мультиплексного считывателя на основе потока. В частности, описано одновременное обнаружение двух подтипов антител (сконфигурированных как IgG/IgM или IgA/IgM) для 3-плексной панели антигенов SARS-CoV-2, которая включает анализы для гликопротеинов Spike S1, Nucleocapsid и Membrane (aka Matrix). Такой подход обеспечивает идеальное предприятие для захвата продольной сероконверсии и вносит ценный инструмент в арсенал против пандемии Covid-19.

Все субъекты были зачислены с письменного информированного согласия с полным одобрением Институционального наблюдательного совета (IRB) Медицинского центра Университета Раша в соответствии с протоколом ORA 20101207 со всеми институциональными руководящими принципами для этического проведения исследований. Кровь собирали с помощью обычной флеботомии в лавандовые вакутайнеры (K₂EDTA) и обрабатывали по рекомендуемым протоколам. Полученную плазму архивировали при -80 °C до тех пор, пока не были проведены оценки.

1. Подготовка антиген-конъюгированных микросфер

1. Выберите три различных флакона магнитных микросфер с уникальными областями бусин, записывая идентификатор бусины и информацию о партии для каждого используемого флакона.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого отдельного микросферного региона будут выполнены следующие шаги. Микросферы чувствительны к свету и должны быть защищены от длительного воздействия света. Во время этапов стирки будьте осторожны, чтобы не нарушить микросферы. При нарушении разрешите второе расстояние в 60 секунд.
2. Вихрь микросферы в течение 60 с и обработка ультразвуком в течение 5 мин перед использованием для диссоциации агрегированных шариков.
3. Переложите 1,0 х 10⁶ шариков в 1,5 мл низкобелковых связывающих микроцентрифужных пробирок.
4. Вставьте трубку в магнитный сепаратор и позвольте отделению происходить в течение 60 с. Когда трубка все еще находится в магнитном сепараторе, осторожно удалите супернатант, не нарушая гранулу шарика.
5. Извлеките трубку из магнитного сепаратора, повторно суспендируйте шарики 100 мкл воды класса ВЭЖХ и вихрь в течение 30 с. Поместите трубку обратно в магнитный сепаратор на 60 с, а затем удалите супернатант. Повторите этот протокол стирки дважды.
6. Извлеките трубку из магнитного сепаратора и повторно суспендируйте промытые микросферы в 90 мкл моноосновного фосфата натрия 100 мМ, рН 6,2 (буфер активации) вихрем в течение 30 с.
7. Добавьте 10 мкл 50 мг/мл Sulfo-NHS (разбавленное буфером активации) в микросферы и осторожно вихрь в течение 10 с. Добавьте 10 мкл 50 мг/мл раствора EDC (разбавленного буфером активации) и осторожно вихрь в течение 10 с. Насиживайте микросферы в течение 20 мин при комнатной температуре (RT) с помощью мягкого вихря каждые 10 мин.
8. Повторите этапы промывки 1,4-1,5 с 50 мМ MES, рН 5,0 (буфер связи) вместо воды класса LC/MS в общей сложности для двух промывок.
9. Извлеките трубку из магнитного сепаратора и повторно суспендируйте шарики со 100 мкл буфера связи вихрем в течение 30 с с последующим добавлением нужного количества белка.
10. Доведите общий объем до 150 мкл с помощью буфера связи. Смешайте реакцию соединения вихрем в течение 30 с и инкубируйте в течение 2 ч путем вращения при РТ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализов, определенных в настоящем описании, конъюгации проводили со следующими концентрациями белка: Spike S1: 5 мкг; Нуклеокапсид: 5 мкг; Мембрана: 12,5 мкг.
11. Повторите этап промывки 1.4 с фосфатным буферизованным физиологическим раствором (PBS)-1% альбумином козьей сыворотки, 0,01% полисорбатом-20 (буфер закалки) вместо воды класса LC / MS в общей сложности две промывки. Повторно суспендировать промытые микросферы в 100 мкл буфера закалки, содержащего 0,05% азида натрия, вихрем в течение 30 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Позвольте бусинам полностью закалиться в течение не менее 6 часов, прежде чем приступать к любой другой процедуре.
12. Подсчитайте количество восстановленных микросфер с помощью автоматизированного счетчика клеток или гемоцитометра. Запишите наблюдаемую концентрацию шариков.
13. Охлаждайте связанные микросферы при 4 °C в темноте.

2. Процедуры

1. Производительность анализа (базовый протокол)
   1. Повторное суспендирование связанных микросфер вихрем в течение 30 с и ультразвуком в течение ~60-90 с.
   2. Извлеките необходимое количество каждого шарикового коллоида из соответствующей трубки и объедините шариковые коллоиды в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
   3. Вставьте трубку в магнитный сепаратор и позвольте отделению происходить в течение 60 секунд. Когда трубка все еще находится в магнитном сепараторе, осторожно удалите супернатант, не нарушая гранулу шарика.
   4. Извлеките шарики из сепаратора, повторно суспендируйте шарики со 100 мкл PBS-1% бычьего сывороточного альбумина, 0,01% полисорбата-20 (буфер анализа) и вихря в течение 30 с. Поместите трубку в магнитный сепаратор и позвольте отделению произойти в течение 60 с. Повторите этот протокол стирки (т.е. шаги 2.1.3-2.1.4) дважды
   5. Отрегулируйте концентрацию 3-ступенчатой рабочей микросферной смеси, добавив соответствующий объем буфера анализа для получения конечной концентрации 100 микросфер на 1 мкл для каждой цели.
   6. Аликвота 12,5 мкл микросферной смеси, приготовленной на стадии 2,1,5 в каждую скважину 384-луночной плиты или 25 мкл в каждую скважину 96-луночной плиты.
   7. Разбавьте образцы плазмы/сыворотки в 500 раз в буфере анализа. Подготовьте стандартные образцы в соответствии с желаемым титрованием.
   8. Добавить 12,5 мкл пробного буфера в качестве заготовительного образца и добавить каждый разбавленный образец или стандарт в каждую обозначенную скважину из 384-луночной пробной пластины или 25 мкл заготовки, разбавленного образца или стандарта в каждую скважину пластины образца из 96 скважин.
   9. Накройте пластину алюминиевым уплотнением или фольгой и инкубируйте в течение 1 ч при RT на пластинчатом шейкере, установленном на 700 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Схема кривых разрежения приведена в таблице 1.
   10. Готовят раствор античеловеческих детектирующих антител (вторичные растворы антител) при 4 мкг/мл с помощью буфера анализа, как указано на этапе 2.1.11.
   11. Получают козий античеловеческий IgM, конъюгированный с Super Bright 436 (SB)/Goat-anti-human IgA, Phycoerythrin (PE) конъюгатные антитела при 4 мкг/мл; или Коза-анти-человек IgM, SB Конъюгат/Коза-анти-человек IgG, ПЭ Конъюгат обнаруживает антитела при 4 мкг/мл.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Для формата пластины с 384 лунками требуется 12,5 мкл/лунка приготовленного раствора вторичных антител, а для пластинчатого формата с 96 лунками требуется 25 мкл/лунка.
   12. Поместите пластину на магнитный сепаратор, быстро промывайте и принудительно переворачивайте над контейнером биологической опасности, чтобы удалить жидкость из скважин. Когда пластина все еще перевернута, силой постучите по тарелке о толстый кусок бумаги.
   13. Промыть каждую лунку 100 мкл пробирного буфера и удалить жидкость путем принудительной инверсии над контейнером биологической опасности, как описано ранее. Повторите эти шаги (2.1.12-2.1.13) в общей сложности для двух промывок. Выбросьте все использованные пачки бумаги в контейнер с биологической опасностью.
   14. Добавьте 12,5 мкл рабочего раствора вторичного антитела в каждую лунку пластины из 384 лунок или 25 мкл в каждую лунку из 96-луночной пластины. Накройте пластину алюминиевым уплотнением или фольгой и инкубируйте в течение 30 мин при RT на пластинчатом шейкере, установленном на 700 об/мин.
   15. Повторите этапы промывки 2.1.12-2.1.13
   16. Добавьте 75 мкл пробирного буфера в каждую скважину 384-луночной пластины или 100 мкл в каждую скважину 96-луночной пластины. Накройте пластину алюминиевым уплотнением или фольгой и инкубируйте в течение 5 мин при RT на пластинчатом шейкере, установленном на 700 об/мин.
   17. Анализ 60 мкл с помощью приборного анализатора в соответствии с системным руководством.
2. Оптимизация времени инкубации при отлове образцов
   1. Выполните шаги, описанные в разделе 2.1, используя продолжительность инкубации 30 мин, 60 мин и 120 мин на шаге 2.1.9.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация может проводиться либо с отдельными пластинами, либо путем паузы на этапе 2.1.6 до момента перехода к этапу 2.1.9. для достижения желаемого времени инкубации.
   2. Приступают к чтению пластин на анализаторе, используя 60 мкл пробирной смеси в соответствии с рекомендациями производителя.
3. Оптимизация концентрации вторичных антител
   1. Выполните эту процедуру, как описано в разделе 2.1, за исключением конечных концентраций реагентов во вторичном рабочем растворе антител (приготовленном на этапе 2.1.10-2.1.11), измененных следующим образом:
      Коза-античеловеческая (или кроличья) IgM, SB-конъюгатная детектирующая антитела при 8, 4, 2, 1 и 0,5 мкг/мл.
      Козье античеловеческое (или кроличье) IgA, PE-конъюгатное обнаружение антител при 8, 4, 2, 1 и 0,5 мкг/мл.
      Козье античеловеческое (или кроличье) IgG, PE-конъюгатное обнаружение антител при 8, 4, 2, 1 и 0,5 мкг/мл.
      Коза-античеловеческая (или кроличья) IgG, PE-конъюгатная/Коза-античеловеческая (или кроличья) IgM, SB-конъюгированные антитела обнаружения при 8, 4, 2, 1 и 0,5 мкг/мл.
      Коза-античеловеческая (или кроличья) IgA, PE-конъюгатная/Коза-античеловеческая (или кроличья) IgM, SB-конъюгированные антитела обнаружения при 8, 4, 2, 1 и 0,5 мкг/мл.
   2. Приступают к чтению пластин на анализаторе, используя 60 мкл пробирной смеси в соответствии с рекомендациями производителя.
4. Оптимизация времени инкубации вторичных антител
   1. Выполните эту процедуру, как описано в разделе 2.1, с 15 мин, 30 мин, 60 мин и 120 мин продолжительности инкубации, определенной в шаге 2.1.14.
   2. Приступают к чтению пластин на анализаторе, используя 60 мкл пробирной смеси в соответствии с рекомендациями производителя.
5. Оценка испытуемых образцов с помощью оптимизированных двухканальных анализов
   1. Сбор образцов плазмы субъекта (n = 4) в дни -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90 и +120 относительно завершения введения вакцины против Covid-19 (т.е. второй дозы).
      ПРИМЕЧАНИЕ: День 0 представляет собой точку времени, в течение которого вакцинация была завершена.
   2. Выполните все анализы с использованием базового протокола (раздел 2.1.) в качестве двухканального анализа IgG/IgM или IgA/IgM.
   3. Нормализуйте результаты до максимально наблюдаемого значения медианной флуоресцентной интенсивности (MFI) для каждого конкретного иммуноглобулина и анализа.

Типичные результаты анализа и оценки эффективности
Анализы иммунобусина обычно обеспечивают сигмоидальную кривую при оценке на несколько (логарифмических) порядков величины, как показано на каждой из панелей, представленных на рисунке 1. Пользователь должен экспериментально определить оптимальный диапазон концентраций для каждого анализируемого вещества в мультиплексе, чтобы определить полный диапазон количественного определения, гарантируя, что не будет чрезмерной выборки экстремальных значений (области, приближающиеся к нижнему пределу количественного определения [LLOQ] или верхнему пределу количественного определения [ULOQ]). Однако фактический диапазон, необходимый для анализа, диктуется распределением целевых аналитов в биологической матрице (т. е. «неизвестных») при данном коэффициенте разбавления. Кроме того, хотя стандартные кривые обычно интерпретируются с помощью линейной регрессии с 4- или 5-параметрическим алгоритмом подгонки, линейная часть данной кривой обычно обеспечивает наибольшую уверенность в количественной точности с линейной (y = mx + b) моделью квантования. Сопоставление калибровочной кривой с наблюдаемыми значениями для неизвестного при данном коэффициенте разбавления должно быть целью разработки количественного анализа.

В связи с этим была оценена 7-точечная стандартная кривая, основанная на последовательном ряду разбавления 1:5 для каждого из антител Spike S1, Nucleocapsid и Membrane, которые варьируются от 1 мкг/мл до 0,000064 мкг/мл для Spike S1 и Nucleocapsid и 5 мкг/мл и 0,00032 мкг/мл для мембраны, как показано на рисунке 1. Нижний предел обнаружения (LLOD) для каждого анализа был определен как самая низкая концентрация анализируемого вещества, которая давала сигнал, отличающийся от его фона. LLOD может быть идентифицирован по уравнению, описанному ранее ^8,9, LLOD = LoB + 1,645 (SD_{низкоконцентрированный} образец). LoB является нижним пределом заготовки, и это «кажущаяся» концентрация анализируемого вещества, которая получается из заготовки, когда ожидается нулевое значение, и это может быть установлено с помощью этого уравнения LoB = Средняя_{заготовка} + 1,645 (SD_blank)⁸. Основываясь на этом методе, значения MFI для анализа Spike S1 варьировались от 134,38 до 20191,2, при этом 134,38 MFI представлял 0,00024 мкг / мл и определялся как LLOD. Для мембранного анализа практический диапазон МФО составлял от 52,24 до 4764,9, при этом 52,24 МФО было рассчитано как 0,004885 мкг/мл и назначено как LLOD. Диапазон MFI для анализа нуклеокапсида составлял от 517,9 до 19666,34, причем 517,9 указывалось как 0,00024 мкг / мл, что было LLOD. Верхний предел детектирования (ULOD) определяется как концентрация анализируемого вещества, после которой изменение МФО уже не является линейным, а отклик сигнала насыщенным. Следует отметить, что полный сигмоидальный характер этих кривых не наблюдается для тестируемых стандартов, за исключением кривой нуклеокапсида. Однако, учитывая наблюдаемые значения МФО для всех неизвестных, проанализированных на сегодняшний день (при разведении 1:500), находятся в пределах представленного диапазона кривых для каждого анализируемого вещества и легко поддаются количественной оценке с использованием 4- или 5-параметрического соответствия с помощью линейной регрессии.

Точность анализа
Точность внутрипробира: Четыре реплики анализов были выполнены на одной пластине для оценки точности анализа, рассчитанной как %CV, или коэффициент стандартного отклонения и среднего значения, умноженного на 100. Для этих таблиц были выбраны стандартные пункты 2 и 5, а значения каталогизированы в таблице 2. Типичный допустимый верхний предельного порога для значений %CV составляет ≤20%, что наблюдалось для этих данных, за исключением порога для стандарта 2 мембранного IgG, который, вероятно, является результатом фоновых уровней и может быть исправлен путем исключения отдаленных значений (данные не показаны). Следует отметить, что явная нестабильность значения считывания наблюдалась для мембранных анализов, где значения МФО составляли <200, чаще всего в случае изотипов IgA и IgM.

Межпробирная точность: Три отдельные партии наборов шариков были подготовлены для каждого анализа и протестированы, как определено для точности внутрипробира (выше и как показано на рисунке 1). Межпробирную вариабельность оценивали путем расчета %CV от средних результатов для каждой из трех партий, как показано в таблице 3. Опять же, верхний предел порога для приемлемого %CV установлен на уровне ≤20%, который существует для всех тестируемых условий (с аналогичным эффектом со стандартом 2 мембранного IgG, как показано выше). Следует отметить, что вариабельность чистых значений МФО от партии к партии обычно наблюдается в нескольких партиях одних и тех же иммунореагентов при разработке пользовательского анализа. Использование калибровочной кривой, построенной из коммерчески полученного антимишенного антитела (например, кролика против Спайка S1), за которым следует антитело для обнаружения антивидов, может обеспечить согласованность результатов анализа и позволить сравнивать несколько партий в разные периоды времени.

Межанализная точность с образцами человека: оценка межпробирной точности была повторена с образцами плазмы человека (n = 5), собранными в течение месяца после первых зарегистрированных симптомов инфекции SARS-CoV-2; выполняется с помощью трех различных партий анализов (т.е. различных приготовлений наборов бисера). Эти результаты показаны в таблице 4 и демонстрируют точность со значением %CV с типичным верхним пороговым предельным значением ≤20%. Усредненные значения %CV для титров Spike S1, Nucleocapsid и Membrane IgG были рассчитаны как 9,9% (диапазон 2,6%-18%), 11,0% (диапазон 3,5%-24,4%) и 7,6% (диапазон 3,2%-12,9%) соответственно. Аналогичные наблюдения были сделаны с титрами IgM и IgA этих трех аналитов, все из которых обеспечивали значения %CV <20%. Единственным исключением из этого правила были титры Субъекта 5 IgM для мембранного белка, который впоследствии был исключен как выброс. Значения точности для оценок человека согласуются с теми, которые были рассмотрены выше для антител кролика, что говорит о том, что эти анализы могут быть легко перенастроены для оценки титров антигенов у нескольких видов с небольшим влиянием на точность анализа. Как отмечалось выше, наблюдалась явная нестабильность считывания значений, наблюдаемая для мембранных анализов, где значения МФО составляли <200, чаще всего в случае изотипов IgA и IgM.

Оптимизация концентрации первичных антител
«Время захвата» анализируемого вещества оценивали с помощью антиген-конъюгированных шариков, а антитела в образцах плазмы или в стандартах тестировали путем изменения длины первичной инкубации (30 мин, 1 ч, 2 ч и 4 ч). Разница в средней МФО представлена как коэффициент конкретной инкубации и максимальное время инкубации, называемое % Max., на рисунке 2, между 30-минутной инкубацией (минимальная продолжительность) и 4-часовой инкубацией (максимальная продолжительность). Значения через 120 мин были оптимальными для титров IgG для антител Spike S1, Мембраны и Нуклеокапсида, что указывает на кинетику связывания быстрых первичных антител, что позволяет гибко увеличивать пропускную способность анализа. Однако для изотипов IgA и IgM (данные не показаны) наблюдалась более медленная кинетика, демонстрирующая пиковые уровни захвата в точке времени 4 часа, как показано на рисунке 2. В целом, существует баланс между приближающейся насыщенностью анализа и практической целесообразностью выполнения каждого анализа в процессе производства (для максимизации пропускной способности). При этом в этих результатах наблюдались подходящие сигналы для количественных целей при минимальном времени инкубации 30 мин для IgG, 60 мин для IgM и 120 мин для IgA.

Оптимизация концентрации вторичных антител
Было протестировано пять концентраций вторичных антител (козий античеловеческий IgG, PE-конъюгированный; козий античеловеческий IgA, PE-конъюгированный; козий античеловеческий IgM, SB-конъюгированный) (0,5, 1, 2, 4 и 8 мкг/мл). Все антитела выявляют широкие диапазоны сигнала, без явного насыщения сигнала в любом состоянии, тем самым обеспечивая линейное измерение для любой из концентраций. Например, средний сигнал, генерируемый анализом Spike S1 с использованием козьего античеловеческого IgM, SB-сопряженного при 0,5 мкг/мл, составлял 13,2% от МФО, генерируемого максимальным сигналом (8 мкг/мл), тогда как МФО, генерируемый из 4 мкг/мл, составлял 73,3% от МФО, проявленного при максимальном сигнале. Подробная информация о диапазоне сигналов от других изотипов антител Spike S1, мембранных антител и антител Nucleocapsid включена в таблицу 5 и рисунок 3. В качестве практического момента первичное воздействие между оптимальной концентрацией вторичного антитела и ранее заявленной концентрацией вторичных антител 4 мкг/мл отражается с точки зрения чувствительности анализа и стоимости анализа. То есть, концентрация вторичных антител 8 мкг/мл может быть желательной для применения с низкими титрами антител или низким количеством ценного образца, но стоимость, связанная с этими анализами, будет значительно выше, чем использование ранее определенной концентрации 4 мкг/мл. И наоборот, в случаях, когда наблюдались высокие титры антител (например, у лиц, перенесших вакцинацию от Covid-19 или с неограничивающими количествами сыворотки), наблюдалась бы экономическая выгода за счет применения более низких количеств вторичных антител (например, 1 мкг / мл).

Оптимизация инкубации вторичных антител
Потенциальное влияние продолжительности инкубации вторичных антител также исследовали путем изменения длины инкубации (15, 30, 60 и 120 мин). Как правило, разница в средней МФО, представленной как коэффициент конкретной инкубации, и максимальное время инкубации, называемое %Max, между 15-минутной инкубацией (минимальная продолжительность) и 120-минутной инкубацией (максимальная продолжительность), не превышала 30%, 55% и 50% для антител Spike S1, мембраны и нуклеокапсида соответственно, что указывает на быстрый кинетический этап связывания вторичных антител и средство для увеличения пропускной способности анализа. В таблице 6 приведены подробные сведения об изменениях сигнала за все время инкубации. Иллюстрации наблюдаемых сигналов из различных инкубаций этого анализа показаны на рисунке 4.

Двухканальная производительность и специфичность
Для каждого анализируемого элемента один формат репортера (только IgG-PE, только IgA-PE или только IgM-SB) сравнивался с сигналом, генерируемым для того же анализируемого вещества, когда он выполнялся в формате с двумя репортерами (например, Spike S1 IgG-PE только против Spike S1 IgG-PE в сочетании с Spike S1 IgM-SB в формате с двумя репортерами). Точность анализа (выраженная как %CV) для сигналов, созданных в двух форматах, была использована для анализа взаимосвязи в результатах этого эксперимента. Значения %CV анализов Spike S1 составили 6,19%, 16,4% и 23% для IgM, IgG и IgA соответственно. Для мембранного анализа значения %CV составили 3,3%, 7,9% и 16,4% для IgM, IgG и IgA соответственно. Наконец, анализ нуклеокапсида предоставил значения %CV на уровне 8,7%, 10,3% и 24,2% для IgM, IgG и IgA соответственно. Значения точности, наблюдаемые для изотипов IgM и IgA, предполагают, что более длительное время инкубации может дать превосходные результаты анализа из-за известных кинетических различий связывания между этими классами иммуноглобулинов. На рисунке 4 показано согласие между форматами различных концентраций вторичных антител.

Чтобы подтвердить специфику репортерских каналов, один репортерский канал был протестирован в одно время, в то время как другой канал был назначен в качестве пустого, чтобы узнать о неспецифическом сигнале (эффект кровотечения). Эти результаты указывают на то, что между двумя репортерными каналами существует незначительное загрязнение кросс-сигнала, учитывая высокую специфичность по всему спектру условий. Эти выводы проиллюстрированы на рисунке 5. В целом, мы наблюдали 6,45% помех через канал 1 на канал 2. Однако, когда была учтена величина сигналов, мы наблюдали следующие потенциальные уровни помех в режиме двойного репортера: Spike IgG / IgM на 71,98%, Spike IgA / IgM на 28,11%; Мембранный IgG/IgM при 7,41%, мембранный IgA/IgM при 134,61%; и нуклеокапсид IgG/IgM на 146,03%, нуклеокапсид IgA/IgM на 112,13%. В указанной конфигурации это потребовало бы измерения Spike IgM в сочетании с изотипом IgA, мембранного IgM с изотипом IgM и измерения нуклеокапидов, не выполненных в двухканальном формате. Этот вывод может потребовать изучения инверсии стратегии маркировки, в соответствии с которой IgA и IgG измеряются в канале 2, а IgM в канале 1.

Оценка событий сероконверсии после вакцинации против Covid-19
Сероконверсия контролировалась у четырех субъектов после оценки IgA, IgM и IgG с помощью анализа Spike S1 в периоды времени от предварительной вакцинации до четырех месяцев после завершения серии прививок от Covid-19. Измерения проводились в двухканальном режиме (IgG/IgM и IgA/IgM, при этом значения IgM были усреднены). Все испытуемые получали вакцину в виде 2-этапной иммунизации в соответствии со стандартной практикой с 21-дневным интервалом между первой и второй дозами. Графики иммунного ответа каждого субъекта показаны на рисунке 6A-C. Значения иммунного ответа для антигенов нуклеокапсида и мембраны наблюдались на фоновых уровнях для всех оцениваемых иммуноглобулинов (данные не показаны), что соответствовало субъектам, не имевшим документально подтвержденной предшествующей инфекции SARS-CoV-2 во время до вакцинации. В целом, наблюдаемые значения Spike S1 IgA и IgM были примерно в 40 раз ниже, чем титры изотипа IgG, причем пиковые титры достигали гребня уже через 14 дней для изотипов IgM и IgG, а изотип IgA достигал пиковых титров между временем второй дозы (день 0) и 14 днями после второй дозы; в зависимости от тематики. Примечательно, что титры Spike S1 IgG начинают распадаться в течение четырех месяцев после завершения вакцинации с очень изменчивой скоростью, в зависимости от субъекта.

Рисунок 1: Репрезентативные 3-плексные стандартные кривые. Репрезентативные стандартные кривые для трех аналитов; представлена в виде 7-точечной последовательной кривой разбавления 1:5, начинающейся с (A) 1 мкг/мл для Spike S1, (B) 5 мкг/мл для мембраны и (C) 1 мкг/мл для нуклеокапсида и антител. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Оптимизация времени инкубации первичного антитела/образца: средний сигнал МФО, полученный из различных времен инкубации первичных антител/образцов (захват антител) в диапазоне от 30 мин до 4 ч для стандартов 1-7 (как указано в таблице 1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Оптимизация концентрации вторичных антител и двухканальная производительность. Кривые иллюстрируют среднюю МФО (нормализованную до самого высокого зарегистрированного значения в серии), полученную из тестируемых вторичных концентраций антител в диапазоне от 0,5-8 мкг/мл. Каждый экземпляр выполнялся как одноканальный, так и двухканальный анализ, чтобы оценить различия в экспериментальном формате. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Оптимизация времени инкубации вторичных антител, двухканальный формат. Репрезентативные графики наблюдаемых значений МФО (нормализованных до наивысшего зарегистрированного значения в серии) относительно времени инкубации с вторичными антителами. Эксперименты проводились в виде двухканальных анализов в виде комбинаций (A-C) IgA/IgM или (D-F) IgG/IgM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Оценка специфичности двухканальных анализов. Результаты анализа двухканального формата анализа с одной из каждой комбинации обозначены как заготовка, чтобы проиллюстрировать отсутствие кросс-канального флуоресцентного или интерференциального. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Иллюстрация сероконверсии после вакцинации против Covid-19. Графики, иллюстрирующие относительные титры антител (A) IgG, (B) IgM и (C) IgA к антигену Spike S1 в ходе вакцинации против Covid-19 (Pre-vaccination – 4 месяца после завершения); время указывается в днях относительно завершения серии прививок; указаны общие моменты введения вакцины (красные линии). Эксперименты проводились в двухканальном режиме, как описано в Протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Серия разбавления для стандартных кривых: Таблица коэффициентов разбавления, используемая для стандартных кривых серотипа IgG; представлена в виде 7-точечной последовательной кривой разбавления 1:5, начинающейся с 1 мкг/мл для α-Spike S1 и α-нуклеокапсида и 5 мкг/мл для α-мембранных антител.

Таблица 2: Точность внутрианализа: Процентный коэффициент дисперсии (%CV), рассчитанный из четырех реплик стандартных смесей антител по стандарту 2 (STD2) и стандарту 5 (STD5) с одной партией анализа в том же эксперименте. Значения, предоставленные для реплик и средних значений, представляют наблюдаемые значения МФО.

Таблица 3: Межпробирная точность со стандартными образцами: Процентный коэффициент дисперсии (%CV), рассчитанный из трех различных партий анализов, оцененных по стандарту 2 и стандарту 5 в одном и том же эксперименте. Значения, предоставленные для реплик и средних значений, представляют наблюдаемые значения МФО.

Таблица 4: Межпробирная точность с человеческими образцами: Средний процентный коэффициент дисперсии (%CV), рассчитанный из трех партий анализов, протестированных с образцами плазмы (разбавленными в 500 раз) у пяти человек с инфекциями SARS-CoV-2.

Таблица 5: Оптимизация концентрации вторичных антител: Средний сигнал МФО продуцируется из различных концентраций вторичных антител в диапазоне от 0,5 мкг/мл до 8 мкг/мл. Значение каждого сигнала также представлено в процентах от сигнала при 8 мкг/мл («Макс.») для демонстрации относительной величины сигнала.

Таблица 6: Оптимизация времени инкубации вторичных антител: Средний сигнал МФО, продуцируемый из разного времени инкубации вторичных антител в диапазоне от 15 мин до 120 мин. Значение каждого сигнала также представлено в процентах от сигнала через 120 мин («Макс.»), чтобы продемонстрировать относительную величину сигнала.

Оценка иммунного ответа на воздействие SARS-CoV-2 в сочетании с эпиднадзором за статусом инфекции на основе ОТ-ПЦР была хорошо описана как рецепт для уточнения хода выздоровления от Covid-19, чтобы служить средством для выявления реконвалесцентной плазмы с потенциальной терапевтической ценностью и для обследования показателей инфицирования на популяционной основе^10,11. Различные примеры понимания сероконверсии у людей включают белковые (антигенные) массивы¹², иммуноблоты¹³, быстрые иммунохроматографические конструкции¹⁴ и иммуноферментные анализы (ИФА)15,16,17. Каждый из этих вышеупомянутых методов может оценивать несколько изотипов иммуноглобулина индивидуально с незначительными изменениями. Эти процедуры, однако, не могут быть практически перепрофилированы, чтобы позволить параллельный анализ нескольких изотипов, как это представлено в этой рукописи, что делает факторы стоимости и пропускной способности ограничениями для их администрирования в стратегии тестирования на основе популяционного масштаба. Некоторые из этих приложений также предоставляют возможность объединять уровни нескольких антигенов параллельно либо в представленном виде, либо в измененных форматах, таких как мультиплексная ИФА ^18,19. Наконец, платформа иммуногранул обеспечивает возможность оценки уровней нескольких антигенов параллельно^20,21, но была ограничена одним эпитопом (т.е. изотипом иммуноглобулина) за анализ, если, однако, не используется недавний инструмент с возможностями «двухканального» анализа.

В этом отчете перечислены протоколы, которые устанавливают надежное измерение нескольких эпитопов в анализе иммуногранулы с использованием инструмента в «двухканальном» режиме в тематическом исследовании сероконверсии людей, вакцинированных covid-19. Метод продемонстрировал отличную точность (% значений CV обычно <20%) с использованием конструкций ручного анализа, которые могут быть улучшены с интеграцией лабораторных автоматизированных систем. Чувствительность анализа и динамический диапазон для всех выбранных аналитов и эпитопов были пригодны для рутинных оценок. Хотя отсутствие коммерчески доступных иммунореагентов антиантигена IgA и IgM ограничивало количественное определение изотипа IgG, такое ограничение не исключает возможности предлагать полуколичественные оценки или оценки относительно конкретного образца в качестве калибранта^22,23.

Подтвержденный анализ иммуногранулы был выделен для исследования сероконверсии в когорте людей, иммунизированных вакциной против Covid-19. В отличие от других подобных платформ, семейство приборов позволяет искать сероконверсию у сотен людей в день в ручном рабочем процессе и тысяч в день в автоматизированной схеме. В целом, эти результаты подтверждают, что «двухканальный» подход имеет соответствующую чувствительность для описания нескольких эпитопов параллельно для идентичного анализа и является жизнеспособным в многоаналитном контексте. Разница в чувствительности к каналу 1 и каналу 2, выполненная с флуорофорами фикоэритрина и Super Bright 436 соответственно, может оправдать разработку конкретного эксперимента для обеспечения получения жизнеспособных аналитических результатов для данного эксперимента. То есть резервирование канала 1 для эпитопов или аналитов более низкой распространенности может быть необходимо для поддержания динамического диапазона анализа, включающего наблюдаемые значения неизвестных. Помимо этого соображения, дизайн анализа был очевиден и должен быть легко доступен для лабораторий с ограниченными аналитическими возможностями. Конечно, это соображение следует взвешивать при рассмотрении помех канала 1 к каналу 2, как мы отметили на рисунке 5, в результате чего помехи от изотипов с более высокой плотностью могут вызывать вводящие в заблуждение аналитические ошибки для тех, кто находится в гораздо меньшем изобилии при измерении в двухканальном формате. Этот потенциал для вмешательства в ситуации с сильно отличающимися концентрациями анализируемого вещества может представлять собой значительное ограничение для подхода, если он не будет должным образом обработан на этапе проектирования анализа.

В заключение был представлен метод быстрого измерения титров антител из основных изотипов иммуноглобулина, связанных с иммунным ответом на инфекцию Covid-19 или вакцинацию. Применение этого подхода продольным образом для оценки сероконверсии может дать представление, которое можно было бы лучше использовать для управления и / или мониторинга течения заболевания или, в качестве альтернативы, руководства перспективными программами бустерной вакцины против Covid-19.

Доктор Борджиа является изобретателем серологического теста, используемого в этой рукописи, которая находится на рассмотрении патента. Статья представлена в описательной форме только без статистического анализа, чтобы избежать потенциальной предвзятости, вызванной конфликтом авторов.

Авторы хотели бы поблагодарить Rush Biomarker Development Core за использование своих объектов, Rush Biorepository для регистрации субъектов и обработки биообразцев, а также Гранты Чикагской сети оценки коронавируса (Chicago CAN) Фонда Уолдера (Chicago CAN) Initiative SCI16 (J.R.S. и J.A.B.) и 21-00147 (J.R.S. и J.A.B.) и награду от Swim Across America Foundation (J.A.B.).