Крысиная модель инфекции мозга EcoHIV

Здесь мы представляем протокол для создания новой крысиной модели активной ВИЧ-инфекции с использованием химерного ВИЧ (EcoHIV), которая имеет решающее значение для улучшения нашего понимания вирусных резервуаров ВИЧ-1 в мозге и предлагает систему для изучения ВИЧ-ассоциированных нейрокогнитивных расстройств и связанных с ними сопутствующих заболеваний (то есть злоупотребления наркотиками).

Было хорошо изучено, что модель мыши, инфицированная EcoHIV, имеет значительную полезность при исследовании неврологических осложнений, связанных с ВИЧ. Создание модели ecoHIV инфицированных крыс для изучения злоупотребления наркотиками и нейрокогнитивных расстройств было бы полезным при изучении нейроHIV и ВИЧ-1-ассоциированных нейрокогнитивных расстройств (HAND). В настоящем исследовании мы демонстрируем успешное создание крысиной модели активной ВИЧ-инфекции с использованием химерного ВИЧ (EcoHIV). Во-первых, лентивирусная конструкция EcoHIV была упакована в культивирование 293 FT-клеток в течение 48 часов. Затем условная среда была сконцентрирована и титрована. Затем мы выполнили двусторонние стереотаксические инъекции EcoHIV-EGFP в ткань мозга крысы F344/N. Через неделю после заражения в инфицированной ткани мозга были обнаружены флуоресцентные сигналы EGFP, что указывает на то, что EcoHIV успешно индуцирует активную ВИЧ-инфекцию у крыс. Кроме того, было проведено иммуноокрашивание маркера микроглиальных клеток Iba1. Результаты показали, что микроглия была преобладающим типом клеток, скрывающих EcoHIV. Кроме того, крысы EcoHIV демонстрировали изменения во временной обработке, потенциальном нейроповеденческих механизмах HAND, а также синаптическую дисфункцию через восемь недель после заражения. В совокупности настоящее исследование распространяет модель EcoHIV инфекции ВИЧ-1 на крыс, предлагающих ценную биологическую систему для изучения вирусных резервуаров ВИЧ-1 в мозге, а также HAND и связанных с ней сопутствующих заболеваний, таких как злоупотребление наркотиками.

Биологические системы улучшили наше понимание нейрокогнитивных расстройств, связанных с ВИЧ-1 (HAND), и лежащих в их основе нейронных механизмов^2. Определение того, какая биологическая система наиболее подходит для любого данного исследования, часто зависит от интересующего вопроса^2. Ограничение диапазона моделей животных-хозяев ставит под вопросы исследования развития болезни ВИЧ-1. Для исследования репликации и патогенеза вируса ВИЧ-1 Potash et al.³ создали мышиную модель активной инфекции ВИЧ-1, заменив кодировку области гликопротеина поверхностной оболочки ВИЧ, gp120, экотропным MLV gp80, что привело к успешной репликации вируса у мышей^4. После инъекций в хвостовую вену у химерных мышей с ВИЧ (EcoHIV) наблюдалось много характеристик, напоминающих характеристики серопозитивных людей ВИЧ-1 (например, инфицированные лимфоциты и макрофаги, нацеленные на противовирусные иммунные реакции, и воспаление^3,5,6).

Хотя мыши и крысы являются членами Muridae, фундаментальные видовые различия могут влиять на их пригодность для конкретных экспериментальных вопросов^7. Таким образом, распространение модели инфекции EcoHIV на крыс (обычно используемой в исследованиях злоупотребления наркотиками и нейрокогнитивных расстройств) было бы выгодным при изучении neuroHIV. Например, их больший размер делает имплантацию яремного катетера для процедур самостоятельного введения лекарств более практичной^8. Методы самостоятельного введения лекарств у крыс были использованы для оценки мотивации при ВИЧ-1^9. Кроме того, многие нейрокогнитивные / поведенческие задачи были первоначально разработаны для крыс^10. Здесь мы сообщаем об использовании стереотаксических инъекций EcoHIV у крыс для расширения модели инфекции EcoHIV и предоставления ключевой возможности для решения новых вопросов, связанных с neuroHIV и HAND.

Все протоколы для животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Южной Каролины (федеральный номер гарантии: D16-00028). Шесть взрослых самцов крыс F344/N были размещены в контролируемой среде при свете 12/12: темный цикл с доступом ad libitum к пище и воде. Обо всех животных заботились в целях использования руководящих принципов, установленных Национальными институтами здравоохранения в Руководстве по уходу за лабораторными животными и их использованию.

1. Упаковка вируса в 293 FT клетки

1. Культивируем 293 FT клетки (5×10⁵/мл) в желатиновые покрытые 75^см2 колбы с DMEM плюс 10% FBS¹¹. Выращивайте клетки при 37 °C, чтобы они были 50% конфюентными при трансфекции.
2. Разбавляют 22,5 мкл трансфекционного реагента (например, Lipofectamine 3000) в 750 мкл среды (например, Opti-MEM) в микроцентрифужной трубке 1,5 мл и вихре в течение 3 с.
3. Развести 20 мкг плазмидной ДНК EcoHIV в 750 мкл среды в микроцентрифужной трубке 1,5 мл и хорошо перемешать.
4. Добавьте разбавленный ДНК в пробирку разбавленного трансфекционного реагента и аккуратно перемешайте. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
5. Добавьте смесь в 10 мл предварительной смременной среды DMEM в колбу 75^см2. Инкубировать клетки в течение 2 дней при 37 °C.
6. Собирают и убирают 24 мл условной среды из двух колбы, в состав которого входит упакованный лентивирус.
7. Центрифуга все 24 мл условной среды при 500 х г в течение 10 минут при 4 °C. Переложите осветленное супернатант в стерильную трубку 50 мл.
8. Смешайте 8 мл концентратора Lenti-x с 24 мл осветленного супернатанта (соотношение 1:3). Перемешать путем мягкой инверсии. Инкубировать смесь при 4 °С в течение двух дней.
9. Центрифужная смесь при 1 500 х г в течение 45 минут при 4 °C. Осторожно удалите супернатант.
10. Осторожно повторно суспендируйте гранулы со 100 мкл 100 мМ PBS.
11. Концентрация вируса титра с набором p24 ELISA.

2. Стереотаксические операции на вирусе EcoHIV-EGFP

1. Обезболивать крыс, используя 3% севофлурана. Переходите к шагу 2.2, когда крысы не реагируют на ядные раздражители и рефлексы отсутствуют.
2. Сбрите волоски из области мозга и стерилизуйте кожу дважды с 70% этанолом и скрабом на основе хлоргексидина. Закрепите крысу в положении лежа в стереотаксическом аппарате.
3. Сделайте разрез (5-6 см) через кожу вдоль средней линии волосистой части головы.
4. Отметьте два положения сверления на 0,8 мм боковой, 1,2 мм ростральной до брегмы. Просверлите отверстие (диаметр 0,4 мм) в каждом положении черепа.
5. Заполните титрованный раствор лентивируса EcoHIV (1,04 × 10⁶ TU/мл) в шприц для инъекций 10 мкл. Закрепите шприц к стереотаксическому аппарату.
6. Сдвиньтесь вниз по игле вплотную к поверхности сверления отверстия. Измеряйте и перемещайте 2,5 мм в глубину.
7. Наполнить 1 мкл раствора вируса со скоростью 0,2 мкл/мин. Держите иглу внутри области инъекции в течение 5 мин. Медленно перемещайте иглу вверх, пока она не появится за пределами черепа крысы.
8. Зашиваем кожу шелковой нитью 4-0.
9. Стерилизуйте разрез 70% этанолом однократно. Подкожно вводят буторфенол (Доролекс, 0,1 мг/кг массы тела).
10. Перенесите крысу в камеру восстановления с грелкой, пока она не проснется.

3. Визуализация участков мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Подождите от одной до восьми недель после вирусной инфузии EcoHIV.

1. Обезболивают крыс 5% севофлураном. Продолжайте двигаться к шагу 3.2, когда крысы не реагируют на пазубные раздражители и рефлексы отсутствуют.
2. Зафиксируйте крысу в положении лежа на спине внутри вытяжного капюшона.
3. Разрезать кожу вдоль грудной средней линии. Разрезать диафрагму и открыть грудную полость.
4. Вставьте 20 г × 25 мм иглы в левый желудочек.
5. Сразу же открыть ножницами правое предсердие.
6. Перфьюсировать 50 мл предварительно охлажденного 100 мМ PBS со скоростью 5 мл/мин.
7. Перфьюировать 100 мл холодного 4% параформальдегида со скоростью 5 мл/мин.
8. Обезглавить крысу, открыть кожу головы и удалить мозг.
9. Постфикс на ночь с 4% параформальдегидом.
10. Переведите мозг на 40 мл 30% сахарозы в 100 мМ PBS в трубке 50 мл до тех пор, пока мозг не всплывет на дно (около 3 дней).
11. Заморозьте мозг в метилбутаноле в течение 2 мин при - 80 °C.
12. Закрепите ткани мозга на металлической платформе внутри криостата -20 °C.
13. Вырежьте корональные срезы толщиной 50 мкм с помощью криостата.
14. Переложите кусочки мозга на стеклянные слайды тонкой кистью.
15. Монтаж секций в 0,3 мл противотеклоплавого средства и покрытие с 22 мм 50 мм обтекательными прорезями.
16. Держите стеклянные горки в темноте при комнатной температуре до высыхания.
17. Визуализируйте целевые нейроны с помощью конфокального микроскопа с помощью Z-стека на основе границ областей мозга и морфологических характеристик нейронов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использовались настройки конфокального микроскопа: увеличение 60 X (A/1,4, масло) и интервал Z-плоскости 0,15 мкм (размер точечного отверстия 30 мкм; обратно проецируемый радиус точечного отверстия 167 нм) с использованием длины волны 488 нм.

Кондиционированная среда была собрана из лентивируса инфицированных EcoHIV-EGFP 293FT клеток. Затем его концентрировали и титровывали, а затем стереотаксически вводили в мозг (кортикальная область) крыс F344/N. Через семь дней после инъекции крыс приносили в жертву и делали изображения с коронарных срезов мозга в диапазоне от брегмы 5,64 мм до брегмы -4,68 мм. На рисунке 1Aприсутствуют значительные сигналы EcoHIV-EGFP по всему мозгу, особенно в коре головного мозга и извилине гиппокампа. Кроме того, двойная маркировка с помощью зондов Iba1 и EcoHIV-EGFP предоставила убедительные доказательства того, что микроглия была преобладающим типом клеток, скрывающим экспрессию EcoHIV в мозге(рисунок 1B). Примечательно, что структура распределения EcoHIV-EGFP согласуется с относительными региональными концентрациями микроглии в мозге крыс (т.е. коре и дентатной извилине гиппокампа).

В последующем исследовании мы подтвердили полезность инфекции EcoHIV у крыс для моделирования ключевых аспектов HAND. Используя протокол, описанный выше, крысам F344/N вводили либо EcoHIV-EGFP, либо физиологический раствор. Во-первых, восемь недель после заражения, временная обработка, потенциальное элементарное измерение HAND^12,оценивали с использованием ингибирования препульса зрительного разрыва(рисунок 2). Животные EcoHIV демонстрировали относительную нечувствительность к манипуляциям с межстимулевым интервалом (ISI), о чем свидетельствует относительно более плоская функция ISI по сравнению с контролем физиологического раствора. В частности, наблюдались значительные различия в наклоне функции ISI от ISI 50 мс до ISI 200 мс (Semilog Line-X - Log, Y - Linear, R²s ≥ 0,99; F(1,2)=642.9, p≤0.001). Во-вторых, баллистическая маркировка использовалась для исследования влияния инъекций EcoHIV-EGFP на морфологию дендритных шипов в средних колючих нейронах (MSN) прилежащего ядра (NAc; Рисунок 3); параметры, которые могут быть использованы для вывода о синаптической функции¹³. Крысы EcoHIV показали глубокие изменения в морфологии дендритного позвоночника, о чем свидетельствует увеличение относительной частоты более коротких дендритных шипов (Genotype x Bin Interaction, F(16, 218) = 4,3, p ≤ 0,001) с увеличенным диаметром головы (Genotype x Bin Interaction, F(12, 96) = 18,7, p ≤ 0,001) и увеличенным диаметром шеи (Genotype x Bin Interaction, F(15, 120) = 16,3, p ≤ 0,001) по сравнению с контрольными животными. Ранее сообщалось о подробной методологии оценки временной обработки¹⁴ и баллистической маркировки^13.

Рисунок 1. Клетки, инфицированные EcoHIV-EGFP, распространяются в мозге крыс. (A) Репрезентативные конфокальные изображения (20x) экспрессии EcoHIV-EGFP в гиппокампе в области извилин или коры через 7 дней после инъекции. (B) Репрезентативные конфокальные изображения (60X) совместной локализации иммуноокрашивания Iba1 с инфицированными EcoHIV-EGFP клетками через 7 дней после инъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2. Инфекция EcoHIV вызывала заметный нейрокогнитивный дефицит во временной обработке. Ингибирование препульса зрительного разрыва проводилось через восемь недель после стереотаксических инъекций EcoHIV или физиологического раствора. Инфекция EcoHIV вызывала заметные изменения во временной обработке, о чем свидетельствует относительная нечувствительность к манипуляциям межстимулированным интервалом по сравнению с контрольными крысами. Подробная методология описана в McLaurin et al.¹³. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3. Инфекционность EcoHIV-EGFP изменяла морфологические параметры дендритных шипов, поддерживая глубокую синаптическую дисфункцию. Крысы EcoHIV продемонстрировали глубокие изменения в морфологии дендритного позвоночника, о чем свидетельствует увеличение относительной частоты более коротких дендритных шипов(A)с увеличенным диаметром головы(B)и увеличенным диаметром шеи(C)по сравнению с контрольными животными. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В этом протоколе мы установили модель ВИЧ-инфекции, индуцированную EcoHIV, у крыс. В частности, мы описали двустороннюю стереотаксическую инъекцию EcoHIV в кору, которая успешно индуцировала активную ВИЧ-инфекцию в мозге крыс через 7 дней после инъекции. Кроме того, мы демонстрируем, что инфекция EcoHIV у крыс может быть хорошей биологической системой для изучения ключевых аспектов HAND. Через восемь недель после заражения EcoHIV у крыс демонстрировались значительные нейрокогнитивные нарушения, которые включали изменения во временной обработке и синаптическую дисфункцию в MSN NAc. Учитывая важность животных моделей для изучения neuroHIV и HAND^2,разработка новой биологической системы может быть выгодной для решения новых вопросов в этой области. Potash et al.³ впервые сообщили об использовании EcoHIV для индуцирования активной инфекции ВИЧ-1 у мышей. В частности, мышей прививали 0,1 мл раствора вируса EcoHIV через инъекции в хвостовую вену^3. Через шесть недель после заражения вирусная ДНК ВИЧ-1 была обнаружена в клетках селезенки и лимфоцитах. Кроме того, одной прививки инъекции EcoHIV было достаточно, чтобы вызвать инфекцию у более чем 75% мышей. Использование двусторонних стереотаксических инъекций, как и в этом исследовании, успешно заразило 100% крыс (n = 6 или n = 4 соответственно), о чем свидетельствует обнаружение EcoHIV-EGFP в мозге через семь дней после инъекции.

Предыдущие исследования показали, что заражение EcoHIV у мышей сильно связано с тем, что микроглия мозга очень восприимчива к вирусной инфекции EcoHIV^3. В этом исследовании в сочетании с иммуноокрашивающим Iba1 (маркер микроглиальных клеток) наблюдалась значительная колокализация сигнала EGFP с клетками Iba1+, что убедительно свидетельствует о том, что микроглия была основным типом клеток для инфекции EcoHIV в мозге крыс. Наблюдения за значительной инфекцией EcoHIV в микроглии согласуются с данными у инфицированных EcoHIV мышей^6,а также ВИЧ-1 серопозитивных людей¹⁵ и других биологических систем, обычно используемых для моделирования ВИЧ^16,17. Мы также выполнили ретроорбитальную инъекцию EcoHIV-EGFP крысам F344 / N, и данные также показали высокую экспрессию EcoHIV-EGFP как в коре, так и в извилине гиппокампа всего через семь дней (данные не показаны). Напротив, инъекция I.P. EcoHIV у крыс F344/N привела к неопределяемой вирусной экспрессии в мозге крыс, несмотря на высокие дозы лентивируса EcoHIV.

Что касается этого протокола, исследователи должны убедиться, что кондиционированная среда, включая упаковку лентивируса EcoHIV в 293 FT-клетках, сконцентрирована и титрована перед использованием для стереотаксической инъекции. Эти шаги имеют решающее значение для обеспечения последовательных и воспроизводимых результатов в экспериментах. Кроме того, мы также обнаружили, что инфекция EcoHIV распространялась от стереотаксической инъекции в мозг до ткани селезенки через 8 недель после инъекции. Между тем, дефицит временной обработки наблюдался у крыс, инфицированных EcoHIV, уже через 14 дней и поддерживался в течение 8 недель после заражения (текущее экспериментальное терминальное время, рисунок 2). По сравнению с обобщенной моделью инфекции EcoHIV у мышей, более специфическая региональная стереотаксическая инъекция EcoHIV вызывала эффективную ВИЧ-инфекцию в областях мозга и вызывала дефицит временной обработки у крыс, что является ключевым для изучения нейрокогнитивной дисфункции, связанной с ВИЧ.

Ограничения, обеспечивающие дополнительные возможности для текущего протокола, включают идентификацию других типов клеток, таких как нейроны и астроциты, изучение изменений в экспрессии EcoHIV-EGFP после инфекции для указания вирусной репликации и латентности в мозге, продольное исследование для устранения потенциальных последствий нейрокогнитивного дефицита, связанного с ВИЧ, и оценку того, уклоняется ли стереотаксическая инъекция EcoHIV от дальнейшего распространения вирусной экспрессии иммунной системы по всему b оди. Кроме того, это должно быть протестировано на других штаммах крыс, чтобы подтвердить обобщаемость инфекции EcoHIV у крыс.

Ни у одного из авторов нет конфликта интересов, о чем можно было бы заявить.

Эта работа финансировалась грантами NIH HD043680, MH106392, DA013137 и NS100624.