Использование иммунофлуоресценции для обнаружения повреждения ДНК, вызванного_{PM 2,5,}в сердцах эмбрионов рыбок данио

Этот протокол использует иммунофлуоресцентный анализ для обнаружения повреждения ДНК, вызванного_{PM 2,5,}в рассеченных сердцах эмбрионов рыбок данио.

Воздействие тонкодисперсных частиц_{(ТЧ 2,5)}может привести к токсичности для развития сердца, но основные молекулярные механизмы все еще неясны. 8-гидрокси-2'дезоксигеназа (8-OHdG) является маркером окислительного повреждения ДНК, а γH2AX является чувствительным маркером для разрывов двухцепочечных ДНК. В этом исследовании мы стремились обнаружить изменения PM_{2,5-индуцированных}8-OHdG и γH2AX в сердце эмбрионов рыбок данио с использованием иммунофлуоресцентного анализа. Эмбрионы рыбок данио обрабатывали экстрагируемыми органическими веществами (EOM) из_{PM 2,5} при 5 мкг/мл в присутствии или отсутствии антиоксиданта N-ацетил-L-цистеина (NAC, 0,25 мкМ) через 2 ч после оплодотворения (hpf). DMSO использовался в качестве управления транспортным средством. При 72 л.с. сердца были рассечены от эмбрионов с помощью шприцевой иглы и зафиксированы и пронизывались. После блокировки образцы были исследованы первичными антителами против 8-OHdG и γH2AX. Затем образцы промывали и инкубировали с вторичными антителами. Полученные изображения наблюдались под флуоресцентной микроскопией и количественно оценивались с помощью ImageJ. Результаты показывают, что EOM от PM_2.5 значительно усиливает сигналы 8-OHdG и γH2AX в сердце эмбрионов рыбок данио. Тем не менее, NAC, действуя как поглотитель активных форм кислорода (ROS), частично противодействовал повреждению ДНК, вызванному EOM. Здесь мы представляем протокол иммунофлуоресценции для исследования роли повреждения ДНК в пороках сердца, вызванных_{PM 2,5,}который может быть применен для обнаружения изменений экспрессии белка в окружающей среде, вызванных химическими веществами, в сердцах эмбрионов рыбок данио.

Загрязнение воздуха в настоящее время является серьезной экологической проблемой, стоящей перед миром. Окружающие тонкодисперсные твердые частицы_{(ТЧ 2,5),}которые являются одним из важнейших показателей качества воздуха, могут переносить большое количество вредных веществ и поступать в кровеносную систему, нанося серьезный вред здоровью^{человека1.} Эпидемиологические исследования показали, что воздействие_{ТЧ 2,5} может привести к повышенному риску врожденных пороков сердца (ИБС)^2,3. Данные экспериментов на животных также показали, что_{PM 2,5} может вызывать аномальное сердечное развитие у эмбрионов рыбок данио и потомства мышей, но молекулярные механизмы сердечной токсичности развития PM_2,5 все еще в значительной степени неизвестны^4,5,6.

Повреждение ДНК может вызвать остановку клеточного цикла и вызвать апоптоз, который может значительно разрушить потенциал клеток-прародителей и, следовательно, ухудшить развитие сердца^7). Хорошо задокументировано, что загрязнители окружающей среды, включая_{ТЧ 2,5,}могут атаковать ДНК через механизмы окислительного стресса^8,9. Как у человека, так и у рыбок данио сердечное развитие чувствительно к окислительной^{нагрузке10,11,12.} 8-OHdG является маркером окислительного повреждения ДНК, а сигнал γH2AX является маркером двухцепочечных разрывов ДНК. N-ацетил-L-цистеин (NAC), синтетический предшественник внутриклеточного цистеина и глутатиона, широко используется в качестве антиоксидантного соединения. В этом исследовании мы используем NAC для изучения роли окислительного стресса в_{PM 2.5}- индуцированном повреждении ДНК^13.

Рыбки данио как модельные позвоночные широко использовались для изучения сердечного развития и сердечно-сосудистых заболеваний человека, поскольку механизмы развития сердца высоко сохраняются среди позвоночных^14,15. Преимущества использования рыбок данио в качестве модели включают их небольшой размер, сильную репродуктивную способность и низкую стоимость кормления. Особый интерес для этих исследований представляет то, что эмбрионы рыбок данио не зависят от кровеносной системы в период раннего развития и могут пережить тяжелую пороки сердца^14. Более того, их прозрачность позволяет непосредственно наблюдать под микроскопом все тело. Таким образом, эмбрионы рыбок данио предоставляют выдающуюся возможность для оценки молекулярных механизмов, участвующих в индукции токсичности сердечного развития в результате воздействия различных химических веществ окружающей среды^5,16,17. Ранее мы сообщали, что окислительный стресс, вызванный_{PM 2,5,}приводит к повреждению ДНК и апоптозу, что приводит к порокам сердца у рыбок данио^18. В этом исследовании мы предоставляем подробный протокол для изучения повреждения ДНК, вызванного_{PM 2,5,}в сердце эмбрионов рыбок данио.

Дикие рыбки данио (AB), используемые в этом исследовании, были получены из Национального ресурсного центра рыбок данио в Ухане, Китай. Все процедуры для животных, описанные здесь, были рассмотрены и одобрены Институтом по уходу за животными Комитета по этике Университета Сучхоу.

1. Отбор проб_{ТЧ 2,5} и экстракция органических соединений

ПРИМЕЧАНИЕ: PM_2.5 был собран в городской местности в Сучжоу, Китай, 1-7 августа 2015 года, как описано^{ранее 5}.

1. Выпекайте 47-мм кварцевые мембранные фильтры в муфельной печи 500 °C в течение 2 ч для удаления органических компонентов.
2. Поместите фильтр в пробоотборник ТЧ_2,5 на 24 ч непрерывного отбора проб.
3. Снимите фильтр и высушите в течение 24 ч при комнатной температуре.
4. Количественно оцените фильтр с помощью аналитического баланса.
5. Экстрагирование органических компонентов из фильтра экстракцией Soxhlet с использованием дихлорметана в качестве растворителя^19.
6. Высушите EOM путем ротационного испарения на водяной бане 60 °C и потока азота. Растворить ЭОМ в ДМСО и хранить при -20 °C.

2. Сбор и лечение эмбрионов рыбок данио

1. Поддерживайте рыбку данио при 28,5 ± 0,5 °C в системе рециркуляторной аквакультуры с 14-ч светлым и 10-ч темным фотопериодным циклом.
2. Поместите здоровых взрослых рыбок данио в аквариум в соотношении 2: 1 между самцами и самками.
3. На следующий день соберите эмбрионы и промыйте их системной водой (т.е. водой для размножения рыбок данио).
4. Отобрать и случайным образом разделить эмбрионы рыбок данио, демонстрирующие нормальное развитие (однородный размер, полные зерна и отсутствие коагуляции яиц) на 4 группы в отдельных стеклянных чашках Петри диаметром 7 см (около 50 эмбрионов на блюдо).
5. Обрабатывайте эмбрионы_{ТЧ 2,5} (5 мг/л) в присутствии или отсутствии NAC при 0,25 мкМ от 2 л.с.ф. до 72 л.с. Используйте ДМСО в качестве контроля транспортного средства до конечной концентрации при 0,1% (v/v).

3. Морфологическое наблюдение за эмбрионами рыбок данио и рассечение сердца

1. При 72 л.с. переносите эмбрионы на стеклянные слайды и наблюдайте под стереомикроскопом. Регистрировать пороки развития сердца, такие как отек перикарда, измененная петля и уменьшенный размер.
2. Рассчитайте частоту пороков развития (процент эмбрионов с пороками сердца от общего числа живых эмбрионов) и проанализируйте различия между группами с использованием односторонней ANOVA, за которой следует тест множественного сравнения Турции (p < 0,05 = статистически значимый).
3. Обезболить эмбрионы 0,6 мг/мл MS-222, чтобы обездвижить их на стеклянных слайдах.
4. Записывайте сердечные удары в течение 30 с и количественно оцените частоту сердечных ритмов с помощью программного обеспечения ImageJ^5,20.
5. Рассекните сердца от эмбрионов рыбок данио с помощью одноразовой шприцевой иглы под стереомикроскопом. Внимание: Избегайте разрушения формы сердца.

4. Иммунофлуоресцентный анализ

1. Чтобы использовать иммунофлуоресцентный анализ для обнаружения повреждения ДНК, вызванного_{PM 2,5,} в сердце эмбрионов рыбок данио, используйте гидрофобную барьерную ручку, чтобы нарисовать круг на чистой стеклянной стороне.
2. Добавьте 50 мкл 4% параформальдегида к 1,25 мл фосфатного буферного физиологического раствора (PBS), чтобы получить фиксаторный раствор.
3. Поместите 3 рассеченных сердца в один гидрофобный барьерный круг и высиживая в течение 20 минут при комнатной температуре.
4. Декантировать раствор под микроскопом и сушить образцы при комнатной температуре не менее 5 мин, чтобы сердца полностью прикрепляли к стеклянным слайдам.
5. Трижды мойте слайды в PBS с 0,1% Tween 20 (PBST) в течение 5 минут на одну стирку.
6. Добавьте 50 мкл бычьего сывороточного альбумина (BSA) к 1000 мкл PBST для получения 5% раствора BSA и инкубируйте слайды во влажной камере в течение 1 ч, чтобы блокировать связывание неспецифических антител.
7. Декантирует раствор и промывает образцы PBST три раза в течение 5 минут на одну промывку.
8. Развести 2 мкл мышиного моноклонального антитела против 8-OHdG и 2 мкл поликлонального антитела кролика против γH2AX в 296 мкл PBST для получения рабочего первичного раствора коктейля антител.
9. Инкубировать образцы сердца с 50 мкл раствора коктейля первичных антител против 8-OHdG и γH2AX в увлажненной камере в течение не менее одного часа при комнатной температуре или ночью при 4 °C (ночная инкубация может увеличить интенсивность сигнала).
10. Декантирует раствор и промывает образцы PBST три раза в течение 5 минут на одну промывку.
11. Развести 1 мкл меченого FITC вторичного антитела против мыши и 1 мкл вторичного антитела против кролика cy3 в 498 мкл PBST для получения рабочего раствора коктейля вторичных антител и инкубировать образцы с вторичными антителами (1:500 в PBST) в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
12. Декантирует раствор и промывает образцы PBS три раза в течение 5 минут за одну промывку, защищенную от света.
13. Добавьте 20 мкл DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндола) в образцы для ядерного окрашивания в течение 30 мин при комнатной температуре.
14. Нанесите накладку на скольжение и запечатайте лаком для ногтей, чтобы предотвратить высыхание и движение. Затем визуйте образцы под флуоресцентным микроскопом и количественно оцените флуоресцентный сигнал области сердца с помощью программного обеспечения ImageJ. Рассчитайте относительные изменения со средним значением контрольных образцов DMSO. Определите статистическую значимость данных, как по состоянию на шаге 3.2.

Этот иммунофлуоресцентный анализ является чувствительным и специфическим методом измерения изменений экспрессии белка в сердцах эмбрионов рыбок данио, подвергшихся воздействию химических веществ окружающей среды.

В этом репрезентативном анализе эмбрионы, подвергшиеся воздействию_{PM 2,5} в отсутствие или присутствие антиоксиданта NAC, оценивались на наличие наличия пороков развития сердца(рисунок 1). Как наблюдалось, EOM от PM_2,5 вызывал значительное увеличение сердечного тератогенеза, такого как отек перикарда, измененная петля и уменьшение размера, по сравнению с сердцами, обработанными контролем DMSO. Частота сердечных сокращений также была значительно снижена у эмбрионов, подвергшихся воздействию EOM(рисунок 1B). Добавление NAC значительно ожимело ЭОМ-индуцированные пороки сердца(рисунок 1).

Здесь иммунофлуоресцентный анализ использовался для измерения экспрессии 8-OHdG и γH2AX у эмбриона рыбки данио для оценки степени повреждения ДНК в тканях, обработанных EOM. Как показано на рисунке 2,уровни экспрессии 8-OHdG и γH2AX были значительно увеличены в сердцах эмбрионов рыбок данио, получавших группу EOM, по сравнению с контрольными, обработанными DMSO сердцами, что указывает на увеличение окислительного повреждения ДНК и разрывов двухцепей ДНК, соответственно. Кроме того, вызванное EOM повреждение ДНК было частично противодействовано добавками NAC(рисунок 2).

Рисунок 1. Пороки сердца эмбрионов рыбок данио при 72 л.с. (A) Изображения эмбрионов рыбок данио при 72 л.с.ф. Пунктирные линии обозначают предсердия (красный) или желудочки (синий). Шкала, 200 мкм. (B) Пороки сердца и частота сердцебиения. Результаты представлены в виде среднего ± SEM. Было исследовано не менее 50 эмбрионов в каждой группе. EOM: EOM в 5 мг/л; NAC: NAC при 0,25 мкМ.. **,P < 0,01; , p<0.001 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2. Повреждение ДНК в сердце эмбрионов рыбок данио на 72 л.с. А) Иммунофлуоресцентное окрашивание. Шкала, 100 мкм. Б) Количественные результаты. Результаты были представлены как средние ± SEM. Было обследовано не менее 15 сердец из каждой группы. EOM: EOM в 5 мг/л; NAC: NAC при 0,25 мкМ. **; P < 0,01; ***; с<0.001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Хотя рыбки данио является отличной моделью позвоночных для изучения токсичности химических веществ окружающей среды для развития сердца, из-за небольшого размера сердца эмбриона трудно получить достаточное количество белка для анализа вестерн-блэт. Поэтому мы представляем чувствительный метод иммунофлуоресценции для количественной оценки уровней экспрессии белка биомаркеров повреждения ДНК в сердцах эмбрионов рыбок данио, подвергшихся воздействию_{PM 2,5.}

Во время рассечения важно сохранить целостность сердца в целости и сохранности. По нашему опыту, относительно легко выполнить изоляцию при 72 л.с. Кроме того, сердце нужно как можно скорее после сбора поместить в фиксационный раствор. Другим важным шагом является сушка образцов, чтобы убедиться, что рассеченные сердца полностью прикреплены к стеклянной горке. В противном случае образцы могут быть смыты со слайда во время маркировки.

Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание выполняется для обнаружения сигналов 8-OHdG и γH2AX в изолированных сердцах. Этот метод не только экономит трудозатраты и позволяет использовать уменьшенный размер выборки, но и облегчает солокализацию двух сигналов. Хотя этот метод на основе антител не может обнаружить флуоресцентные сигналы у живых эмбрионов, этот быстрый протокол может быть использован для обнаружения экспрессии белка в изолированных сердцах эмбрионов рыбок данио.

Часто сообщалось, что окислительный стресс опосредует ТЧ_{2,5-индуцированное}повреждение ДНК^8,9. Чрезмерная выработка АФК может привести к повреждению ДНК и апоптозу во время эмбрионального развития рыбок данио^21,22,23. Как мы ранее сообщали^18,повышенная экспрессия сигналов 8-OHdG и γH2AX наблюдается в сердцах эмбрионов рыбок данио, подвергшихся воздействию EOM, экспрессия которых значительно противодействовает лечению NAC-мусорщика АФК. Примечательно, что NAC не полностью обращает вспять экспрессию сигнала повреждения ДНК, вызванную_{PM 2,5,}что указывает на то, что окислительный стресс может лишь частично способствовать повреждению ДНК, наблюдаемым в сердцах эмбрионов рыбок данио, подвергшихся воздействию PM_2,5.

В заключение, этот метод использует чувствительный метод для обнаружения повреждения ДНК, вызванного_{PM 2,5,} в неповрежденных сердцах эмбрионов рыбок данио. Кроме того, метод может быть применен для обнаружения изменений экспрессии белка в сердцах эмбрионов рыбок данио, подвергшихся воздействию других химических веществ окружающей среды.

Авторам нечего раскрывать.

Эта работа была поддержана Национальным фондом наук о природе Китая (номер гранта: 81870239, 81741005, 81972999) и Приоритетным академическим программным развитием высших учебных заведений Цзянсу.