Приготовление экстракта белка и ко-иммунопреципиентация от Caenorhabditis elegans

Этот метод описывает протокол для высокопровереного приготовления экстракта белка из образцов Caenorhabditis elegans и последующей ко-иммунопреципиентации.

Методы со-иммунопреципиентации часто используются для изучения белково-белковых взаимодействий. Подтверждение гипотетизированных белково-белковых взаимодействий или выявление новых может дать неоценимую информацию о функции белка, представляющий интерес. Некоторые из традиционных методов приготовления экстракта часто требуют трудоемких и трудоемких методов. Здесь модифицированный протокол подготовки экстракта с использованием гомогенизатора бисерной мельницы и металлических бусин описывается как быстрая альтернатива традиционным методам приготовления белка. Этот метод подготовки экстракта совместим с исследованиями совместного иммунопреципиентации ниже по течению. В качестве примера метод был использован для успешного со-иммунопреципита C. elegans микроРНК Argonaute ALG-1 и двух известных взаимодействующих ALG-1: AIN-1 и HRPK-1. Этот протокол включает описание сбора образцов животных, подготовки экстракта, уточнения экстракта и иммунопреципиентации белка. Описанный протокол может быть адаптирован для проверки взаимодействия между любыми двумя или более эндогенными, эндогенно помеченными или переэкспрессируемыми белками C. elegans в различных генетических предпосылках.

Определение макромолекулярных взаимодействий интересного белка может быть ключом к получению дополнительной информации о его функции. Иммунопреципиентация и эксперименты по со-иммунопреципиетации могут быть использованы для определения всего взаимодействия белка с помощью крупномасштабных^{протеомных подходов 1 или} для конкретного тестирования способности белка совоккупляться с гипотетическим взаимодействователем. В C. elegans,оба метода были успешно использованы, чтобы узнать больше о деятельности различных белков, в том числе тех, которые тесно функционируют с микроРНК для^{регулирования экспрессии}генов 2^,3,4. Эксперименты по со-иммунопреципиентации имеют преимущество тестирования белково-белковых взаимодействий в их родной клеточной среде, но подготовка экстракта может быть сложной и трудоемкой. Необходим эффективныйлиз образца, но необходимо позаботиться о том, чтобы свести к минимуму нарушение белково-белковых взаимодействий. Методы, такие как douncing⁵, sonication⁶, Balch гомогенизации⁷, и циркония бисер-гомогенизации^8,9 были использованы для успешного подготовки C. elegans общего белка экстрактов. Эти методы, за исключением гомогенизации бисера zirconia, имеют ограничения с точки зрения количества образцов, которые могут быть обработаны одновременно. Представлен альтернативный метод, который может быть легко масштабируется, чтобы обеспечить высокую пропускную способность, быстрый препарат экстракт белка из образцов C. elegans с последующим со-иммунопреципиетации. В частности, метод может подготовить до 24 образцов одновременно, значительно сократив время, необходимое для подготовки экстракта. В отличие от этого, например, douncing обычно позволяет только один образец подготовки за один раз. Этот метод экстракта может быть использован для подготовки экстрактов из любой стадии развития C. elegans.

Описанный является пошаговая процедура для сбора образцов животных, экстракт подготовки, иммунопреципиентации, а также представление западных blotting данных для подтверждения успешного стягивания белка и обнаружения со-иммунопрециплиатации белка интереса. Для демонстрации эффективности протокола были проведены два эксперимента по со-иммунопреципиентации между 1) микроРНК Argonaute ALG-1 и AIN-1, гомологом GW182; и 2) ALG-1 и HRPK-1, недавно выявленный взаимодействующих ALG-1². ALG-1 и AIN-1 являются основными белками, которые составляют микроРНК-индуцированного глушиния комплекса (miRISC) и взаимодействие между этими двумя белками хорошо^{создана 10,11}. Протокол подготовки экстракта был эффективен в эксперименте по совместной иммунопреципиентации ALG-1-AIN-1. Этот протокол также успешно подтвердил взаимодействие между ALG-1 и его недавно выявленным взаимодействутелем, HRPK-1^2.

Таким образом, рукопись описывает протокол подготовки экстракта C. elegans, который может быть расширен до одновременного процесса 24 образцов вместе с протоколом совместного иммунодефицита, который может быть использован для выявления новых или подтверждения гипотетизированных взаимодействий между белками. Протокол подготовки экстракта совместим с рядом экспериментов ниже по течению, включая иммунопреципиентирование^{белка 2} и микроРНК стягивания¹². Кроме того, протокол иммунопреципиентации может быть адаптирован для проверки взаимодействия между любыми двумя или более эндогенными, эндогенно помеченными или переэкспрессированными белками C. elegans в различных генетических предпосылках.

1. Коллекция образцов червей

1. Семя смешанной стадии или^{синхронизированы 13} червей на NGM твердых пластин при требуемой температуре и позволяют червей расти до желаемой стадии. Для базового роста и обслуживания C. elegans, пожалуйста, см. Stiernagle et al. и Порта-де-ла-Рива^{и др. 14,13}.
2. Соберите червей в 15 мл конической центрифуги трубки путем мытья червя пластин с буфером M9.
3. Пеллет червей центрифугирование при 400 х г при комнатной температуре (RT) в течение 2 мин и отказаться от супернатанта.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размер гранул червя для приготовления экстракта составляет от 100 мл до 500 йл. Гранулы упакованных червей объемом 300 л рекомендуются для экспериментов по иммунопреципиентации ниже по течению и обычно дают 4,5 мг общего белка, в то время как гранулы в 500 л дают 7,5 мг общего белка.
4. Выполните дополнительные 3-5 моет с буфером M9 (см. таблицу 1) или до тех пор, пока супернатант больше не облачно.
5. Выполните одну окончательную стирку с ddH₂O.
6. Переместите гранулы червя в 1,5 мл микроцентрифуг трубки и спина вниз на 400 х г на RT в течение 2 мин. Отбросьте оставшийся супернатант, чтобы получить упакованные гранулы червя и приступить к извлечению подготовки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь. Червь гранулы могут быть заморожены в жидком азоте немедленно и хранится при -80 градусов по Цельсию или в жидком азоте. Обратите внимание, что гранулы червя могут быть разморожены только один раз и не могут быть переоценены.

2. Извлечение подготовки червя гранулы

ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовление экстракта должно проводиться на льду или при 4 градусах Цельсия.

1. Если заморожены, оттепель червь гранулы на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если желаемый упакованный червь гранул размером 300 йл не был получен во время сбора образцов, несколько меньших гранул могут быть объединены до тех пор, пока достаточно материала присутствует для дальнейшей экстракции.
2. Добавьте равный объем ледяного 2x лиза буфера (60 мМ HEPES, рН 7,4, 100 мМ хлорид калия, 0,1% Тритон X, 4 мМ хлорид магния, 10% глицерол, 2 мМТ СВ С ингибитором RNase, ингибитор протеазы и ингибиторы фосфатазы; см. Таблицу 1) и вихрь или пипетку вверх и вниз, чтобы смешать. Спин трубки (ы) вниз, чтобы собрать смесь в нижней части трубки.
3. Переместите смесь в 1,5 мл без rNase трубку, содержащую металлические бусины (см. Таблица материалов)и положить образец в гомогенизатор бисерной мельницы (см. Таблица материалов) при 4 градусов по Цельсию. Убедитесь, что крышки трубки затягиваются и образцы сбалансированы внутри гомогенизатора.
4. Гомогенизировать образец на самой высокой скорости (установка 12) в течение 4 мин.
5. Удалите образец из бисера и поместите его в новую микроцентрифугную трубку 1,5 мл. Кроме того, магнит, обеспеченный гомогенизатором, может быть использован для удаления бисера из образца.
6. Спин вниз экстракт на 19000 х г в течение 20 мин при 4 градусов по Цельсию, чтобы прояснить экстракт белка.
7. Перенесите супернатант в свежую трубку 1,5 мл на льду, избегая переноса белого, облачного осадка, который образуется поверх образца. Супернатант теперь является уточненным экстрактом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сохранить 10 йл очищенного экстракта, чтобы определить общую концентрацию белка.
8. Используйте экстракт немедленно для следующих экспериментов или вспышки заморозить экстракт в жидком азоте и хранить при -80 градусов по Цельсию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь. Экстракты могут храниться при сверхнизкой температуре (-80 градусов по Цельсию или жидкого азота в течение 6 месяцев). Замороженные экстракты могут быть разморожены один раз и не могут быть переморожены.
9. Определите общую концентрацию белка экстракта с помощью набора анализа концентрации белка, совместимого с моющими средствами (см.таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя.

3. Иммунопреципиентация

ПРИМЕЧАНИЕ: Все иммунопреципиентные шаги для приготовления экстракта должны быть выполнены на льду или при 4 градусах Цельсия. Рекомендуется использовать 2 мг общего белка для каждого иммунопреципиентации. Тем не менее, были выполнены успешные иммунопреципитации с 0,8-1 мг общего белка. Всегда используйте свежие или свежеотмороженные белковые экстракты. Следующий протокол изложен для выполнения иммунопреципиентации от 2 мг общего белка, или одного эксперимента иммунопреципиентации. Количество бисера и антитела может быть увеличено или уменьшено соответственно для множественных образцов или если по-разному количество выдержки протеина использовано.

1. Поместите или оттаивать экстракт белка на льду. Образец можно разбавить до 10 мг/мл или 5 мг/мл с ледяным 1x буфером лиза (см. таблицу 1).
2. Переусердуйтесь с магнитными бусинами путем инверсии и перенесите 150 МКЛ 50% бусинок в трубку 1,5 мл. Намагничить бисер на льду против магнитной подстоять в течение 1 мин или до тех пор, пока решение ясно. Отбросьте супернатант.
3. Снимите трубку с магнитной подстоя и вымойте бусинку в 1x лизе буфера с помощью 2 томов (т.е. 300 МЛ) суспензии бисера. Повторите мыть 2x в общей сложности три моет.
4. Перезагнете бисер в 150 МКЛ ледяного лиза буфера.
5. Передача 75 л суспензии бисера на 2 мг экстракта белка и инкубации при 4 градусов по Цельсию в течение 1 ч с нежным возбуждением. Сохранить оставшиеся подвески шарика на льду для более длительного использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется для уменьшения неспецифического связывания белка с бисером во время шага иммунопреципиентации.
6. Поместите трубку с образцом на магнитном стенде на льду в течение 1 мин или до тех пор, пока шарики полностью намагничены и образец не будет ясен. Перенести супернатант на новую трубку 1,5 мл; не беспокоить бисер. Это предварительно очистимый белок лизат. Сэкономьте 10% выборки для анализа западных помарк.
7. Добавьте 20 мкг очищенного антитела к предварительно очищенному лизату и инкубировать при 4 градусов по Цельсию в течение 1 ч с нежным возбуждением.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество антител, используемых для иммунопреципиентации специфичен для антител и белка и должно быть эмпирически определено для обеспечения эффективной иммунопреципиентации целевого белка.
8. Добавьте оставшиеся 75 МКЛ предварительно промытой подвески бисера (шаг 3,5) в смесь антител/лизата и инкубировать в течение 1 ч при 4 градусах с нежным возбуждением.
9. Поместите трубку в магнитную подсвечку на льду в течение 1 мин или до тех пор, пока шарики полностью намагничены и образец не будет ясен. Сохранить супернатант для анализа западной помарки (необязательно).
10. Вымойте бисер, содержащий иммунопреципитат 3x в 450 мкл буфера мытья (30 мМ HEPES, рН 7,4, 100 мМ хлорид калия, 0,1% Тритон X, 2 мМ хлорида магния, 10% глицерол, 1 мМ ДТТ; см. таблицу 1) на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные мойки могут быть выполнены, если более строгие условия стирки являются предпочтительными.
11. Resuspend шарик гранулы в 20 йл 2x SDS/ BME белка гель загрузки буфера (см. Таблица материалов) и денатуры путем кипения при 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут до загрузки на SDS-PAGE гель. Кроме того, денатурированные образцы могут храниться при -20 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Часть иммунопреципита бисера может быть сохранена для изоляции РНК вниз по течению, при желании.

4. Обнаружение западными помарками образцов ИС

1. Загрузите образцы IP на гель SDS-PAGE (см. таблицу материалов). Избегайте передачи бисера, поместив IP трубки на магнитной подготе в течение 1 мин до аспирации образца.
2. Выполните западные blotting^15,16 и^{антитела окрашивания 16 со} следующими изменениями: разбавить антитела ALG-1¹⁷ 1:500 в 5% обезжиренного сухого молока (NFDM); разбавить антитело^{HRPK-1 2} 1:1,000 в 5% NFDM; и разбавить ain-1^{антитела 18} 1:10,000 в 5% NFDM. Вторичные антитела (см. Таблицуматериалов) использовались в соответствии с инструкциями производителя.
3. Обнаружить полосы с HRP основе хемилюминесценции (см. Таблицу материалов).

Этот протокол (схема на рисунке 1) был успешно использован для получения C. elegans общего экстракта белка(рисунок 2) для вниз по течению иммунопреципибилизации^{нескольких белков 2} (Рисунок 3 и рисунок 4). Представленный протокол гомогенизатора бисероплетительной мельницы был сопоставим по суммарным извлечениям белка сметодами на основе дунса (рисунок 2)и эффективно извлеченным ядерным (COL-19:GFP(NLS) (рисунок 2)и цитоплазмическимибелками (рисунок 3 и рисунок 4). Одновременно было извлечено несколько образцов различных размеров(рисунок 2). Белки Argonaute взаимодействуют с членами белкового семейство GW182, образуя миРИСК, которые связываются с РНК-посланниками цели и подавляют их^{экспрессию 10.} На рисунке 3 показана успешная ко-иммунопреципитация основных компонентов миРИСК ALG-1 и AIN-1, в соответствии с^{предыдущими отчетами 11,17}. В последнее время были предприняты усилия по выявлению дополнительных белковых взаимодействующих Argonaute^{ALG-1 3, с} тем чтобы узнать больше о том, как биогенез и активность микроРНК могут регулироваться вспомогательными факторами. РНК-связывающий белок HRPK-1 был выявлен в иммунопреципитатах^{ALG-1 3.} Это взаимодействие было недавно подтверждено в ответном эксперименте по иммунопреципиентации^{HRPK-1 2.} Представленные протоколы экстракта и иммунопреципиентации успешно восстановили ALG-1 в HRPK-1-специфических со-иммунопрециатетатах(рисунок 4). Кроме того, взаимодействие ALG-1-AIN-1 было протестировано на различных генетических фонов и HRPK-1 было показано, что ненужным для ALG-1/AIN-1 miRISC^{сборки 2} (Рисунок 3). Дополнительные цифры предоставляются, чтобы показать полную мембрану зондировать(Дополнительный рисунок 1).

Рисунок 1: Схема рабочего процесса для препарата экстракта C. elegans и иммунопреципиентации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Западное сравнение помарки ядерной локализованной GFP, COL-19::GFP (NLS), уровней в подготовленных и гомогенизированных образцах от 250 йл и 100 гранул червя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: GW182 гомолог AIN-1 со-иммунопрециатетов с ALG-1. Западные пятна для белков ALG-1 и AIN-1 в иммунопреципитатах ALG-1. На ко иммунопрецибилацию ALG-1/AIN-1 отсутствие hrpk-1 не повлияло. Входные данные - 10% ОТ ИС. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: ALG-1 со-иммунопрециатирует с HRPK-1. Показана западная блоттинг для HRPK-1 и ALG-1 в иммунопреципитатах HRPK-1. Входные данные - 10% ОТ ИС. Указывает на антитела тяжелой цепи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Таблица 1: Рецепты

Дополнительная цифра 1. Показаны полностью исследованные западные мембраны помарки, используемые для генерации рисунков 2-4. (A) Зондная мембрана для рисунка 2. Обратите внимание, что мембрана была разрезана, чтобы обеспечить одновременное зондирование для GFP и Tubulin, уменьшая общий размер помарки. (B) Зондная мембрана для рисунка 3. (C) Зондная мембрана для рисунка 3. «обозначает тяжелую цепь антител. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

C. elegans является отличной моделью для изучения фундаментальных вопросов в клеточной, молекулярной и биологии^{развития 19}. В дополнение к своей силе в качестве генетической модели системы, C. elegans является подлежен биохимических подходов, в том числе, но не ограничиваясь, белка иммунопреципиентации и ко-иммунопреципиентации. Одним из потенциальных препятствий при проведении иммунопреципиентных экспериментов является отсутствие антител, характерных для белков, представляющих интерес. Если антитела не доступны, пользовательские поликлональные или моноклональные антитела могут быть созданы. Тем не менее, последние инновации в технологии редактирования генома позволили исследователям быстро ввести мутации или тег эндогенных генов C. elegans ^20,21, облегчая исследования, которые распутывают генетические, функциональные и физические взаимодействия между генами и закодированными белками. В частности, CRISPR/Cas9-опосредованная пометка генов C. elegans в эндогенных локусах снизила зависимость иммунопреципиентных экспериментов от наличия антител, сделав эксперименты по совместной иммунопреципиентации гораздо более осуществимыми. Гены C. elegans могут быть помечены различными тегами, начиная от флуоресцентных тегов, таких как GFP или mCherry, и до небольших тегов, таких как FLAG и HA. Антитела, распознающие эти метки, легко доступны на коммерческой основе, облегчая изучение белково-белковых взаимодействий с помощью иммунопреципиентных подходов.

Представленный протокол, изложенный на рисунке 1,может быть выполнен для небольшого числа образцов или расширен, что позволяет одновременно готовить до 24 образцов. В то время как первоначальные характеристики белково-белковых взаимодействий с помощью иммунопреципиентации обычно проводятся в условиях дикого типа в нормальных условиях выращивания, последующие исследования часто требуют тестирования белково-белковых взаимодействий в различных генетических фонов или в различных условиях роста. Возможность одновременно готовить несколько экстрактов экономит время и, что важно, обеспечивает согласованность подготовки экстракта между различными образцами. Отрицательный контроль всегда требуется, при этом идеальным элементом управления является нулевая мутация в гене, кодирующей иммунопрециализированный белок, представляющий интерес (см. рисунок 3 и рисунок 4 для примеров).

Этот протокол экстракта позволяет быстро готовить экстракт белка из образцов C. elegans и сравним с гомогенизацией на основе бисера^{zirconium 8.} Гомогенизация бисера в целом может быть увеличена до нескольких одновременных препаратов образца с использованием различных гомогенизаторов бисерной мельницы или аналогичного оборудования. Некоторые более экономичные гомогенизаторы бисерной мельницы могут уменьшить количество образцов, которые могут быть обработаны одновременно, однако. Кроме того, представленный протокол экстракта совместим с подготовкой экстракта на основе dounce, что представляет собой экономичную альтернативу. Хотя различные гомогенизаторы бисерной мельницы не были протестированы, большинство из них, вероятно, будут совместимы с этим протоколом экстракта белка, до тех пор, как полное нарушение образцов C. elegans достигается.

Как представлено, этот протокол подготовки экстракта совместим с несколькими экспериментами вниз по течению, включая^{иммунопреципиентность белка 2} и микроРНК выдвижной¹² и позволяет вниз по течению сбора белков и РНК компонентов. Он также эффективно извлекает как ядерные, так и цитоплазмическиебелки (рисунок 2, рисунок 3и рисунок 4). Аналогичным образом, представленный протокол иммунопреципиентации позволяет РНК-изоляцию от связанных с белком иммунопреципиетов. В то время как протокол иммунопреципиентации был первоначально разработан для выявления взаимодействующих белков ALG-1, метод может быть адаптирован для проверки взаимодействия между любыми белками, представляющими интерес. В самом деле, иммунопроципиентации условия, используемые работал одинаково хорошо для иммунопреципиентации ALG-1(рисунок 3) и HRPK-1 (Рисунок 4). Этот протокол является отличной отправной точкой для иммунопурификации РНК-связывающих белков. Вместе с тем следует отметить, что для других белков, представляющих интерес, могут потребоваться некоторые изменения в составе буфера. Изменения могут зависеть от физических и биохимических свойств белка интереса и должны осуществляться на каждом конкретном случае.

После того, как целевой белок (здесь, ALG-1 или HRPK-1) иммунопреципилитирован, западные blotting могут быть использованы для тестирования со-иммунопрецивитата для конкретных взаимодействующих белков.

Кроме того, копурифицированный иммунопреципитат может быть подвергнут анализу масс-спектрометрии для выявления всех мяуковых взаимодействующих белков. Подтвержденные взаимодействия совместного иммунопреципиентации могут быть изучены в различных генетических фонов или условий для выявления потенциальной регуляции конкретного взаимодействия. Например, для определения роли hrpk-1 в сборке ALG-1/AIN-1 miRISC, С копреципиентирование ALG-1-AIN-1 оценивалось как в фоновом режиме дикого типа, так и при отсутствии HRPK-1(рисунок 3). было установлено, что hrpk-1 может быть незаменим для взаимодействия ALG-1/AIN-1² (рисунок 3). Кроме того, технология редактирования генома CRISPR/Cas9 может быть использована для генерации мутаций удаления одной точки или домена в интересах белков. Повторное тестирование способности генерируемых мутантов к совоккупетит с их белка взаимодействующих может выявить, какие домены или остатки посредников физического взаимодействия. Такие будущие исследования могут дать бесценную информацию о механизме функции белка и регулирования. Эти подходы, в сочетании с силой генетики C. elegans, могут дать важное представление о фундаментальных молекулярных процессах, которые регулируют развитие животных и клеточной функции.

Авторов нечего раскрывать.

Эта работа была частично поддержана Канзас ИНБРЕ, P20GM103418 Ли и Зиновьева и R35GM124828 в Зиновьева. Мы благодарим Мин Хана за щедрый обмен антителами против АЙН-1. Некоторые из штаммов, используемых в ходе этой работы были предоставлены Caenorhabditis Генетический центр (CGC), финансируемых NIH Управление по программам научно-исследовательской инфраструктуры (P40 OD010440).