Измерения одного липосом для изучения Протон насосные мембранных ферментов с использованием электрохимии и Флюоресцентная микроскопия

Здесь мы представляем протокол изучать молекулярный механизм Протон транслокации через липидные мембраны одной липосом, с использованием цитохрома Бо₃ в качестве примера. Сочетая электрохимии и микроскопии флуоресцирования, изменения рН в просвете одного везикулы, содержащие один или несколько фермента, могут быть обнаружены и анализируются индивидуально.

Протон насосные ферменты электрона передачи цепи пара окислительно-восстановительных реакций в Протон транслокации через мембрану, создавая Протон движущей силы, используемые для производства АТФ. Амфифильных характер мембранных белков требует особого внимания к их обработки, и растворения в среду естественный липидный незаменима при изучении процессов переноса мембран как Протон транслокации. Здесь мы подробно метод, который был использован для исследования механизма Протон насосные мембраны окислительно-восстановительных ферментов, принимая цитохрома Бо₃ от кишечной палочки в качестве примера. Сочетание электрохимии и флуоресцентной микроскопии используется для управления состоянием редокс хиноны бассейн и монитор изменений рН в просвете. Из-за пространственное разрешение флуоресцентной микроскопии сотни липосомы могут быть измерены одновременно в то время как содержание ферментов может быть уменьшен на одного фермента или транспортер в липосомы. Анализ соответствующих одного фермента может выявить закономерности в фермента функциональной динамики, которая в противном случае могут быть скрыты от поведения населения в целом. Мы включать описание скрипта для автоматизированного анализа.

На уровне ансамбля или macroscale с населением фермента в тысяч до миллионов молекул, где измерения представляют среднестатистический обычно информации о механизмах фермента и кинетика. Это известно, однако, что сложные макромолекулы как ферменты могут демонстрировать разнородность в их поведении и молекулярные механизмы на уровне ансамбля не обязательно верны для каждой молекулы. Такие отклонения в масштабе отдельных молекулы были широко подтверждены исследования одного ферментов с различными методами, возникающих в ходе последних двух десятилетий¹. В частности флуоресценции обнаружения отдельных ферментативной активности был использован для расследования гетерогенность ферментов активность^2,3 или обнаружить эффект так называемой памяти (периоды преуспело в периоды низкой активности высокой ферментов активность и наоборот)^4,5.

Многие исследования одного фермента требуют, что ферменты иммобилизованных на поверхности или пространственно фиксированной в еще один способ оставаться достаточно долго, в поле зрения для непрерывного наблюдения. Было показано, что фермент инкапсуляции в липосомах включить иммобилизации фермента и предотвращения любых негативных последствий из-за поверхность фермента или белок белковых взаимодействий^6,7. Кроме того липосомы предлагают уникальную возможность для изучения одного мембранных белков в их естественный липидный бислой окружающей среды^8,9,10.

Класс мембранных белков, транспортеры, осуществляет направленного транслокации веществ через клеточную мембрану, поведение, которое можно изучать только когда белки будут преобразованы в липидных бислоев (например, липосомы)^{11, 12,13}. Например Протон транслокации, выставлены несколько ферментов цепи переноса электронов прокариот и эукариот, играет важную роль в клеточное дыхание, создавая Протон движущая сила используется для синтеза АТФ. В этом случае Протон, насосные деятельность сочетается электрона передачи, хотя детальный механизм этого процесса часто ускользает.

Недавно мы продемонстрировали возможность флуоресцентного обнаружения пара с электрохимии для изучения Протон накачки активность ферментов одного терминала убихинола оксидазы Escherichia coli (цитохромы Бо₃) Восстановленный в липосомах¹⁴. Это было достигнуто путем инкапсуляции рН чувствительной мембраны непроницаемый Люминесцентную краску в Люмене липосомы, подготовленных от э. coli полярных липидов (рис. 1A). Количество белка был оптимизирован так, что большинство липосомы либо содержащиеся не или только одна молекула восстановленный фермента (в зависимости от распределения Пуассона). Два субстратов цитохрома Бо₃ были предоставлены путем добавления убихинон смесь липидов, который сформировал липосомы и кислорода (окружающей среды) в растворе. Липосомы затем малонаселенных адсорбированные на полупрозрачных Сверхплавное золото электрода, покрытые собственн-собранные монослоя 6-mercaptohexanol. Наконец электрод монтируется на нижней части простого spectroelectrochemical клеток (рис. 1B). Электрохимический управления хиноны бассейн окислительно-восстановительного состояния позволяет гибко запустить или остановить ферментативной реакции в любой момент, в то время как рН чувствительных краска используется для мониторинга изменений рН внутри просвета липосомы результате Протон транслокации, ферменты. С помощью интенсивности флуоресценции второй, липидов прыгните Люминесцентную краску, размер и объем отдельных липосомы могут определяться и таким образом количественной фермента Протон, насосные деятельности. Используя эту технику, мы особенно обнаружили, что цитохромы Бо₃ молекулы способны войти в состояние спонтанной утечки, что быстро рассеивается Протон движущей силой. Цель этой статьи заключается в внедрения метода измерений одного липосомы в деталях.

1. Подготовка смеси липидов/UQ-10/FDLL

Примечание: E. coli липиды используются для приготовления липосомы должно быть aliquoted и тщательно смешивается с убихинон-10 (фермент субстрата) и длинноволновых Флюоресцентная краска меченых липиды (для определения размера липосомы) до восстановление.

1. С помощью шприца стекла, промаркированные передачи акций хлороформ полярных липидов выписка из Escherichia coli (25 мг/мл) в стеклянных флаконах сделать аликвоты 5 мг.
2. Добавьте 50 мкл 1 мг/мл убихинон-10 (UQ-10; в хлороформе) на липиды сделать окончательный соотношение UQ-10: липиды масштаба 1: 100 (1% w/w).
3. 20 мкл 1 мг/мл (0,4% w/w) длинноволновых Флюоресцентная краска меченых липидов (FDLL), в смесь липидов/UQ-10.
4. Однородный раствор хлороформ на коротких vortexing и выпарить большую часть хлороформ под нежный поток азота или аргона. Полностью удалите следы хлороформа дальнейшее испарение под вакуумом для по крайней мере 1 час.
   Примечание: Липидов аликвоты могут храниться в инертной атмосфере при-20 ° C в течение нескольких месяцев.

2. Восстановление цитохрома Бо₃

Примечание: Для очистки цитохрома Бо₃ от кишечной палочки, следуйте протокол от Rumbley и др. ¹⁵ для обеспечения высокой чистоты образцов изначально сложить фермента, добавьте размер-гель-проникающей хроматографии после Шаг очищение сродства, характеризуется Rumbley et al. ¹⁵

1. Мкл 312.5 40 мм MOPS-Кох/60 мм K₂,₄, рН 7,4, чтобы один Алиготе липидов/UQ-10/FDLL сухой смеси (5 мг, шаг 1.4) и смешать с вихревой до липидной пленки полностью высокомобильна, следуют 2 мин лечения в ультразвуковой ванне.
2. 125 мкл 25 мм 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic кислоты (МК), pH фактора Люминесцентную краску, которая должна быть инкапсулированным липосомы.
3. 137.5 мкл 250 мм n октиловый β-D-glucopyranoside (OGP) сурфактанта, смешать с использованием вихря и sonicate ультразвуковой водяной бане 10 минут, чтобы убедиться, что все липиды являются солюбилизирован в мицеллах ПАВ. Перенесите дисперсии в 1,5 мл пластиковую трубку.
   Примечание: Облачно подвеска липидов должна стать прозрачной после солюбилизация с ПАВ.
4. Добавьте необходимое количество цитохрома Бо₃ (см. Примечание ниже) и добавить сверхчистой воды, чтобы сделать общий объем 50 мкл (цитохромы решение Bø₃ плюс вода). Инкубируйте на 4 ° C на 10 мин на роликовый миксер.
   Примечание: Типичный для условий одной фермента составляет 0,1 – 0,2% (w/w белково липидные, т.е. 5-10 мкг белка), хотя она может быть увеличена до 1 – 2% (50-100 мкг белка), если цель заключается в том, чтобы наблюдать только электрохимические деятельность (см. ниже). Как отрицательный контроль липосомы без цитохрома Бо₃ может быть подготовлен.
5. Весят 2 x 50 мг и 2 x 100 мг полистирола микрошарики в четыре 1,5 мл труба шапки и закрыть парафином пленкой для предотвращения высыхания.
   Примечание: Перед использованием, полистирола микрошарики должны быть вымыты с метанолом, воды и хранятся в воде согласно инструкции производителя.
   Примечание: Если используется смесь вода/microbead, полистирола микрошарики можно удобно быть переданы крышку с микропипеткой с широким наконечником. Вода может затем удален из микрошарики, с помощью микропипеткой с тонким кончиком.
6. Добавьте 1^st50 мг полистирола микрошарики в растворения смесь (шаг 2.4), надевая крышку с полистирола микрошарики 1,5 мл пластиковые трубки с дисперсией и выполняя короткие спина на пару секунд. Инкубируйте на 4 ° C на Роликовый Смеситель для полистирола микрошарики адсорбировать ПАВ для 30 мин.
   1. Повторите добавлениями полистирольные микрошарики и инкубаций следующим: добавить 50 мг микрошарики для 60 мин инкубации; Добавьте 100 мг микрошарики для 60 мин инкубации; и добавить 100 мг микрошарики для 120 мин инкубации.
      Примечание: Решение выше поселились микрошарики превратит полупрозрачные во время шага 2.6, как образуются proteoliposomes.
7. Отдельные решения proteoliposome из полистирола микрошарики, с помощью микропипеткой с тонким кончиком. Разбавить дисперсии в 90 мл 20 мм MOPS-Кох/30 мм K₂так₄, рН 7,4 (МОПЫ буфера) и передачи в трубке ультрацентрифуга Ti45.
8. Ультрацентрифуги дисперсии, используя тип 45 Ti ротор в 125 000 x g (r_Макс) за 1 ч до Пелле proteoliposomes.
   Примечание: Меньше пробирок может использоваться хотя разрежения в большой буферный объем помогает уменьшить концентрацию не инкапсулированные ЮНИСТИЛ в окончательном подвеска.
9. Отбросить супернатанта, промойте окатышей с 20 мм MOPS-Кох/30 мм K₂,₄, рН 7,4 буфера (без resuspending гранулы). После отмены промывки буфера, вновь приостановите proteoliposomes в 500 мкл буфера MOPS, закупорить его взад и вперед с тонкий кончик микропипеткой. Затем переезд в 1,5 мл пластиковую трубку.
10. Центрифуга подвеска для 5 мин при 12000 g x для удаления мусора. Перенесите супернатант (восстановленный proteoliposomes) в новый флакон.
11. Сохранить восстановленный proteoliposomes дисперсии на 4 ° C на ночь и использовать в течение 2 дней.

3. Изготовление полупрозрачные Золотые электроды

Примечание: Золото гладкая поверхность получается 30 Нм толстый слой золота 99.99% из атомарным образом гладкой кремниевой пластины зачистки методом шаблон. Небольшая толщина золотого слоя имеет важное значение, поскольку она должна быть полупрозрачным разрешить флуоресценции наблюдения. Подробная информация о золотым напылением (физическое парофазное осаждение, PVD) можно найти в других местах¹⁶ и только шаблон зачистки покрыта здесь. Кроме того Сверхплавное золотые фишки могут быть приобретены в другом месте (см. Таблицу материалы).

1. Клей до 9 стекла Крышка скользит (0,17 мм) на поверхность выварочная золота, с использованием эпоксидной низким флуоресценции bi компонента. Вылечить клея при 80 ° C для 4 ч.
2. Как раз перед модификация с собственн-собранные монослоя (шаг 4) Отсоедините скользит крышка стекла из кремниевых пластин с лезвием. Из-за тонкости скользит крышка заботиться при отключении скользит крышка не треснуть или сломать стеклянных скольжениях.

4. модификация поверхности золота с собственн-собранные монослоя (SAM)

1. Подготовьте 5 мл водного раствора 1 мм 6-mercaptohexanol (6MH).
2. DIP свежезаваренным отдельностоящий золото покрытием крышки скользит (шаг 3.1) в 6MH раствор и оставить на 20-25 ° C на ночь (> 16 h) сформировать SAM.
   Примечание: Тиоловых решения имеют неприятный запах, поэтому закрытый сосуд должен использоваться при инкубации золото покрытием крышки выскальзования.
3. Следующий день, удалить золото покрытием крышки выскальзования из 6MH раствора, кратко мыть с водой или метанола и затем изопропанолом. Сухой под нежные газового потока.

5. электрохимические тестирование Proteoliposomes деятельности

Примечание: Электрохимическая активность фермента сначала проверяется на слое тесно Упакованные липосомы (шаг 5) и Нижняя везикул покрытия используются в одном везикулы эксперимент для измерения изменения рН в просвете липосомы (шаг 6).

1. Соберите золото покрытием покрытие скольжения spectro электрохимической ячейки (см. Рисунок 1). Сделать контакт для золота с плоской проволоки за пределами области, заданной резиновое уплотнительное кольцо.
2. Добавить 2 мл буферного раствора электролита и поместите ссылку и Электроды вспомогательные в ячейку.
   Примечание: Чем более подробно говорится в разделе обсуждение, электроды ссылки без хлорида предпочтительны для предотвращения формирования АС (I) Cl в электрохимии. Здесь, Hg/Hg₂т₄ (сб. K₂т₄) электрод сравнения используется и потенциалы даны по сравнению с Стандартный электрод водорода (SHE) с помощью 0.658 V против она для Hg/Hg₂т₄ (сб. K₂так₄).
3. Запуск электрохимических импедансной спектроскопии (0,1 Гц – 100 кГц) на открытой ячейке потенциальных (OCP) потенциал для оценки качества Сэм. Преобразование значения импеданса для допуска и разделить на 2πω участок Коул-Коул сюжет, где ω — частота (см. следующие ссылки^16,17,18 подробные сведения о преобразовании и интерпретации импеданс спектры).
   Примечание: Компактный и плотной Самс 6MH должны дать закрыть полукруга Коул-Коул участок и дать значения емкости в диапазоне 2,5-3,0 МКФ/см² (рис. 2A). Если получены значительные отклонения от форму полукруга или емкость вне диапазона значений, измените электрода.
4. Запуск пустой циклических voltammograms (CVs) с сканирования 100 и 10 МВ/s в регионе потенциальные-0.3 – 0,8 V. Типичная CV показано на (рис. 2B, пунктирная линия).
   Примечание: Это должно продемонстрировать почти чисто емкостной поведение и отсутствие значительных faradaic тока, даже в условиях атмосферного кислорода используется здесь.
5. Добавить proteoliposomes (0,5 мг/мл концентрация окончательный липиды, 1-2% (w/w) соотношение липидов цитохрома Бо₃ ) электрохимической ячейки и слегка перемешать с пипеткой. Подождите, пока адсорбции proteoliposomes на поверхности электрода готовой (30-60 мин при комнатной температуре).
   Примечание: Циклический voltammograms (CVs) на 10 МВ/s может выполняться во время адсорбции proteoliposomes следить за процессом. Адсорбция завершается, когда подряд CVs остановить изменение. В следующих учебниках можно найти информацию о методах CV. ^{19 , 20}
6. Мыть ячейки, изменяя буферный раствор, по крайней мере 10 раз, но избежать оставляя поверхности электрода полностью сухой.
7. Запустите электрохимических импедансной спектроскопии OCP (рис. 2A, синяя линия) чтобы убедиться, что Сэм на электроде-золото остается неизменным и CVs с сканирования ставки 10 и 100 МВ/s соблюдать убихинола каталитического окисления (и сокращения кислородная) цитохрома Бо ₃ начало потенциалов сокращения электрохимических хиноны о 0 V против она) (рис. 2B).

6. Определение ферментативные Протон накачки микроскопии флуоресцирования

1. Измените золото электрод как в шаге 5, но с использованием 100 x менее proteoliposomes по сравнению с шагом 5.5 (т.е., 5 мкг/мл). Для исследования одного фермента, снизить Ботситохрома₃ соотношение липидов до 0,1-0,2% (w/w).
   Примечание: Липосомы будет редко адсорбироваться на поверхности электрода, позволяя один пузырек мониторинг по микроскопии флуоресцирования. В этих условиях сингл фермента количество фермента, лишенных подвижности на поверхности электрода является недостаточным для наблюдения каталитического тока.
2. Место электрохимической ячейки на нефть цели (60 X) Перевернутый флуоресценции микроскоп с каплей масла для погружения. Используя соответствующие фильтры для флуоресценции FDLL, сосредоточиться на поверхности электрода. Одноместный липосомы должен появиться как яркие пятна на дифракционный предел Микроскоп/цели. Возьмите изображения FDLL флуоресценции.
3. Переключиться на один из ЮНИСТИЛ флуоресценции наборы фильтров на микроскопе для проверки, что ЮНИСТИЛ флуоресценции четко видны и отличить от фона (в то время выбранной экспозиции, см. шаг 6.4). Увеличение интенсивности света, если это не так.
4. Программа Микроскоп программное обеспечение для выполнения загрузки приурочен изображений, чередуя два ЮНИСТИЛ наборы фильтров (меню приложений | Define/Run приобретение ND). Задайте задержку между изображения приобретений минимум. В этом эксперименте используйте 1 s облучения и 0.3 s Задержка (из-за башни движения).
   Примечание: Соотношение между интенсивностью флюоресценции в этих двух каналов будет позже преобразована в рН внутри липосомы в каждый момент времени. Продолжительность приобретения может варьироваться по курсу ожидаемых рН; в этой статье используется 5 мин.
5. Настройте параметры потенцио изменить потенциал во время захвата изображений. Например, в этом эксперименте, используйте следующую последовательность: 0 – 60 s: никакой потенциал применяется (т.е. OCP); 60-s: 180 – 0,2 V (против она); 180-300 s: 0.4 V (против она). В этом случае, только прикладной потенциал на втором этапе (– 0,2 V против она) достаточно эффективно уменьшить хиноны бассейн.
6. Запустите одновременно приобретение приурочен изображения (микроскоп) и потенциальных последовательности (потенцио), вручную запустив оба измерения в то же время.
   Примечание: Эксперимент может повторяться на электроде-же несколько раз путем перемещения микроскопа в другую область на поверхности. Задержка между приобретений должно быть по крайней мере 5-10 мин для обеспечения полной рН уравновешивания липосом на поверхности. Различные длительности и потенциальные модели могут применяться в зависимости от необходимости, хотя изображений время ограничено из-за Фотообесцвечивание ЮНИСТИЛ во время приобретения.

7. Анализ изображений флуоресцирования

Примечание: Типичный эксперимент производит набор изображений с шаг по времени (например, 2.6 s) для каждого из двух каналов, то есть, (продолжительность * 2 / 2.6) изображения. Пример такой набор записанных во время эксперимента одного фермента изображений доступны через репозиторий исследования данных Лидс²¹. Обработка изображений состоит из нескольких шагов, используя Фиджи (ImageJ) и высокого уровня математического анализа, язык программирования (далее как сценарии программного обеспечения, смотрите Таблицу материалов для подробной информации).

1. Используйте Фиджи отдельный файл промежуток времени, выровнять изображения и сохранять как отдельные каналы и сроки.
   1. Открытое время перерыва файл, используя Bioformats импортера в Фиджи (команда макрос: запустить («био-форматы импортер»)).
   2. Использовать плагин StackReg для выравнивания каждого кадра к первой для учета возможных стадии движений или тепловой дрейф произошла во время приобретения (команда макрос: запустить («StackReg», «трансформация = перевод»)).
   3. Сохраните отдельные несжатые файлы для каждого канала и каждый шаг по времени в формате TIFF в одну папку.
   4. Извлечь точное время марок для каждого кадра из метаданных файла промежуток времени и сохранить их в виде CSV-файла в той же папке, что и изображения. Кроме того экстракт штампы времени с помощью приобретения программного обеспечения и вручную сохранить в CSV-файл с помощью программного обеспечения таблицы.
      Примечание: Папка с изображениями и штампы времени теперь готов для анализа сценариев программного обеспечения. 7.1.1 шаги. – 7.1.4. может быть автоматизирована с помощью сценария Фиджи (сценарий, написанный на Python для пакетной обработки файлов промежуток времени, использовать «Ctrl-Shift-N» (в Windows), а затем файл | Открыть для загрузки скрипта).
2. Использование сценариев программного обеспечения для автоматизированной обработки изображений. Загрузить указанный код программного обеспечения и нажмите кнопку запустить до конца. При появлении запроса выберите папку, содержащую изображения с шагом 7.1.
   Примечание: Сценарий для анализа предоставляется как живой сценарий mlx формате, с обширные комментарии, для выявления единого липосомы, подогнать их функции 2D-Гаусса, их фильтрации и подсчитать значения рН в каждый момент времени. Следующие вложенные действия выполняются автоматически при выполнении сценария.
   1. Загрузите все изображения сроков для одного эксперимента в память.
   2. В среднем все изображения для одного канала (выберите канал с высокой интенсивностью флуоресценции) и использовать усредненный изображение для выявления все максимумы, которые могут соответствовать одной липосомы.
   3. Fit выявленных максимумов на среднем изображение для 2D-Гаусса функционировать и сохранить полученный подходят параметры для каждого липосомы (см. рис. 4A например установлены липосомы).
   4. Фильтр максимумов согласно ожидаемый единый липосомы критерии, такие как размер, цикличность и интенсивности. Отклонить липосомы, которые установлены плохо из-за низкой сигнал/шум, тесно соседних липосом или слишком близко к краю изображения.
   5. Загрузить отметки времени из внешнего файла и подходят каждой фильтрованной липосом функции 2D-Гаусса на каждом изображении сроки отдельно.
      Примечание: Использование параллельного программирования и многоядерных ЦП может значительно повысить скорость вычисления на данном этапе.
   6. Фильтр липосомы снова согласно аналогичные критерии как шаг 7.2.4 но прикладной для каждого периода времени.
   7. На каждом шаге по времени определите соотношение интенсивности флуоресценции липосом как отношение томов, окруженная установлены функции 2D-Гаусса на два канала. Вычислить рН от соотношение интенсивностей определяется из двух каналов ЮНИСТИЛ и использовании калибровочной кривой (шаг 8). Участок результирующие кривые рН время для липосомы и наблюдать их рН изменения при применении потенциал.

8. выполнение калибровочной кривой ЮНИСТИЛ флуоресцирования

Примечание: Чтобы преобразовать ЮНИСТИЛ флуоресценции соотношение intravesicular рН, калибровочной кривой должны быть сначала учредила что будет учитывать особые условия экспериментов, таких, как золото пропускания, качество фильтры, и т.д. Этот шаг должен выполняться только один раз или два раза и калибровочные данные могут использоваться как параметры настройки и измерения остаются неизменными в шаге 6.

1. Подготовьте электрода с редкой адсорбированных липосомы (без цитохрома Бо₃ как описано в разделе шаги 5 и 6.1).
2. Добавьте 2 мкл раствора 0,1 мг/мл грамицидина в этанол в 2 мл буфера для создания концентрации 100 нг/мл.
3. Захват двух изображений флуоресценции для двух каналов ЮНИСТИЛ.
4. ТАК изменить pH клетки путем добавления небольших аликвоты 1 М HCl или 1 M H₂₄. Измерение pH буфера с стандартный pH метр и захватить два изображения флуоресценции для двух каналов ЮНИСТИЛ.
5. Повторите шаги 8.4 для рН 6-9.
6. С помощью алгоритма от 7.2, подходят, фильтрации и вычислить среднее соотношение ЮНИСТИЛ флуоресценции отдельных липосом при каждом pH. Захватить ЮНИСТИЛ соотношение среднего все липосом.
7. Соответствовать результате рН коэффициент зависимости к следующим уравнением:
   , где pK, R и R_bустановку параметров.
8. Воспользуйтесь pK, R и R_bпреобразовать ЮНИСТИЛ соотношение отдельных липосомы шаге 7.2.7. для значения рН.

Качество золота модифицированные покрытие скольжения (электрод) с СЭМОМ 6MH проверяется перед каждой эксперимент с электрохимических импедансной спектроскопии. Рисунок 2A показывает представитель участки Коул-Коул, измеряется с использованием электрохимических импедансной спектроскопии, до и после адсорбированные липосомы. Если качество Сэм является достаточным, импедансной спектроскопии должны продемонстрировать почти чисто емкостной поведение в участке Коул-Коул полукруга. Диаметр полукруга в участке Коул-Коул равняется емкости двойной слой поверхности электрода, который должен быть в диапазоне 2,5-3,0 МКФ/см² . Обратите внимание, что емкость следует существенно не изменяется при адсорбции липосомы, хотя незначительное увеличение емкости могут наблюдаться (высокая липосомы покрытия, рисунок 2A, внизу) или небольшой сдвиг в сопротивление может наблюдаться при низких частоты (низкая липосом покрытий, рисунок 2A, сверху).

Электрохимия может использоваться для тестирования каталитическую активность цитохрома Бо₃ в proteoliposomes, где каталитического течения измеряется с циклической вольтамперометрии отражают активность Оксидоредуктазы убихинола кислорода. Однако значительный каталитического токи могут быть обнаружены только в больших количествах адсорбированные proteoliposomes и необходимо тщательно упакованный слой proteoliposomes на золото модифицированные крышка выскальзования. Рисунок 2B демонстрирует представитель циклических voltammograms (CVs) электрода до и после липосомы адсорбции с охватом либо низкой или высокой липосом. Не faradaic тока наблюдается на пустой CV, потому что уменьшение кислорода голые золото электродом блокируется SAM. Когда поверхность насыщен липосомы с высоким цитохрома Бо₃ контента (1,3% (w/w) в данном случае), ясно каталитического волны вследствие сокращения кислородная наблюдается с начала потенциал 0 V, т.е. потенциал убихинон уменьшение (Рисунок 2Б, синяя линия). Убихинон бассейн действует как естественный субстрат для фермента и как посредник электрона, перенос электронов от фермента к поверхности электрода. Мы отмечаем, что под покрытие высокой липосом, никакого различия отдельных пузырьков возможно при микроскопии и нижнего покрытия необходим для исследования одного липосом. Освещение низкой липосомы (но высоким содержанием белка соотношение липидов) каталитической тока значительно уменьшается, едва отличимым от фона (рис. 2B, красная линия). Обратите внимание, что в условиях одного фермента (низкое содержание белка соотношение липидов), стимулирующую тока еще ниже и не может быть надежно исчислена.

Рисунок 3 показывает изображения флуоресценции липосом, адсорбированные на электродах в трех различных покрытий. Все изображения были взяты в одинаковых условиях света и воздействия и их яркость была скорректирована в равной степени чтобы включить прямое сравнение. Краситель содержащих липосомы видны на изображениях как яркие пятна. Центральной частью изображения был photobleached на пару минут, чтобы выявить уровень флюоресценции фона (мы отмечаем, что FDLL относительно фотостабилен и не photobleached полностью на рис. 3). Изображения на двух каналах ЮНИСТИЛ superimposable, где соотношение между двумя каналами (410/535 и 470/535) соответствует рН 7,4, используемые в этом эксперименте. Большее количество липосомы являются видимыми с FDLL каналом, который указывает на присутствие липосомы, которые имеют не ЮНИСТИЛ инкапсулирован. Разница между каналами ЮНИСТИЛ и FDLL более выраженным на выше покрытий, возможно потому, что на покрытие высокой липосом, липосомы большей вероятностью лопнуть или предохранитель на поверхности.

Анализ изображений требует выравнивания рамы (против первого кадра) с использованием ImageJ, плагин StackReg. Выравнивание незаменима в большинстве ситуаций, так как небольшие тепловой дрейф образца обычно происходит в сроки эксперимента, изменение координат липосом. Все дальнейший анализ выполняется с использованием сценариев программного кода. Этот код выполняет автоматическое липосом идентификации. Как размер липосомы ниже дифракционного предела Аббе, их флуоресценции рассматривается как точка распространения функция гораздо больше, чем диаметр фактической липосомы (Рисунок 4A). Код соответствует интенсивности флуоресценции каждой везикул на двух каналах функции 2D-Гаусса (рис. 4A) и вычисляет отношение их объемные интенсивности, которые могут быть преобразованы в рН, используя калибровочной кривой. Выполняя эти действия на всех таймфреймах, pH получается внутри каждый пузырек в сроки эксперимента (фильм 1). Рисунок 4B показывает Медиан всех изменений рН везикул в пределах одного изображения, когда Бо₃ содержание цитохрома-1,3%. Увеличение рН (Протон накачки) отчетливо видны, когда потенциал между -0,1 и-0.3 V применяется, но не для 0 V с момента последнего не является достаточным для уменьшения хиноны бассейн. Когда содержание цитохрома Бо₃ гораздо ниже (белково липидные соотношения 0.1%, рис. 4 c), средний кривые становятся почти неотличимы от тех пустых липосом (рис. 4 d). Это различие становится очевидным при рассмотрении отдельных рН следы случайных липосомы (рис. 5, 6 и 7). Липосомы без цитохрома Бо₃ отображаются изменения не значительные рН в отношении шума (рис. 7), выбор липосомы (преимущественно) показывают увеличение или уменьшение рН, когда потенциал применяется что активы цитохром Бо₃ (цифры 6, серая зона). Очевидная разница в рН следы между липосомы согласуется с низкой белково липидные соотношения, где цитохрома Бо₃ присутствует только в небольшое подмножество липосомы деятельности. Распространенность на рН больше, чем снижение объясняется методом растворения, который способствует «внешней» ориентации молекул фермента (ОК. 75%). Фракция липосомы, отображающих изменение рН увеличивается, когда цитохрома Бо₃ соотношение липидов является выше (Рисунок 5). Также обратите внимание, что некоторые липосомы остановки перекачки протонов и войти в режим распыления Протон до конца потенциального применения. Мы связываем это поведение молекул цитохрома Бо₃ , ввода «утечка государства», которая позволяет протонов течь обратно в просвете липосом¹⁴.

Дальнейший анализ следов рН, включая их установку и определение Протон накачки/утечка ставки может быть сделано с помощью сценария мы опубликовали ранее^14,22 и могут быть получены из Лидс хранилища данных исследований ^{23 , 24}.

Рисунок 1: принцип метода. (A) принцип мониторинга активности одного фермента и (B) схема экспериментальной установки, используемые в этой работе с выреза для демонстрации внутренней частью ячейки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: электрохимические реакции липосом. (A) Коул-Коул участки измеряется в OCP (0.22 V против она; черный квадрат линия) до и после липосомы (1,3% w/w цитохрома Бо₃) адсорбции из растворов в концентрации 5 мкг/мл (красный круг линии) и 500 мкг/мл (синий круг линии). (B) циклические voltammograms на 100 МВ/s (левая панель) и 10 МВ/s (правая панель) АС-Сэм (черная пунктирная линия) до и после липосомы (1,3% w/w цитохрома Бо₃) адсорбции из растворов в концентрациях 5 мкг/мл (красная линия) и 500 мкг/мл (синяя линия). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: микроскопии флуоресцирования липосом. Флуоресценции изображения липосом на различные поверхности покрытий: поверхности инкубировали 30 мин липосомы раствором 5 мкг/мл (верхняя строка), 20 мкг/мл (средний ряд) и 500 мкг/мл (Нижняя строка). Левый столбец соответствует 470/535 Нм возбуждения/выбросов Настройка фильтра (1^st ЮНИСТИЛ канал); Средняя колонка - 410/535 Нм (2^nd ЮНИСТИЛ канал); правая колонка - 560/645 Нм (FDLL канал). Изображения были взяты в масштабе 90 X (60 X 1,5 X увеличением Микроскоп перед камерой и цель), 1 s экспозиции и аналогичные интенсивности света. Масштаб бары соответствует 50 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: липосом идентификации и изменения рН. (A) 3D-вид частью флуоресценции изображения, содержащие типичный одной липосом. Его интенсивность флуоресценции рассматривается как точка распространения функция (цвет поверхности), которая оборудована для функции 2D-Гаусса (черная сетка). РН (B-D), отображаются как Медиана всех пузырьков в пределах зоны одного изображения (обычно несколько сотен) в различных прикладных потенциалов. От 0-60 s, применяется не потенциал (OCP). Между 60 и 180 s (серая зона) были применены различные потенциалы: 0 V (черный),-V (красный), 0,1 – 0,2 V (зеленый),-0.3 V (синий). От 180 до 300 s, 0.4 V против. Она была применена. Цитохром Бо₃ липидные соотношения были (B) 1.3%, (C) 0.1%, (D) 0%. Следы смещение для ясности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: рН следы липосомы, содержащие 1,3% фермента. Следы рН изменить 72 один липосом, случайно выбранных, содержащие цитохрома Бо₃ (1,3% w/w) измеряется и проанализированы в течение одного эксперимента. От 0-60 s, является потенциал не применяется (OCP); между 60 и 180 s (серая зона) – 0,2 V против. ОНА; от 180 до 300 s, 0.4 V против. Она была применена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6: рН следы липосомы, содержащие 0,1% фермента. Следы рН изменить 72 один липосом, случайно выбранных, содержащие цитохрома Бо₃ (0,1% w/w) измеряется и проанализированы в течение одного эксперимента. От 0-60 s, является потенциал не применяется (OCP); между 60 и 180 s (серая зона) – 0,2 V против. ОНА; от 180 до 300 s, 0.4 V против. Она была применена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7: рН следы липосомы без фермента. Следы изменения рН 72 один липосом, случайно выбранных, без цитохрома Бо₃ измеряется и проанализированы в течение одного эксперимента. От 0-60 s: Никакой потенциал будет применяться (OCP); между 60 и 180 s (серая зона) – 0,2 V против. ОНА; от 180 до 300 s, 0.4 V против. Она была применена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Фильм 1: анимация изменения рН одного липосом. (Верхняя панель) Изменение липосом флуоресцирования на двух каналах ЮНИСТИЛ (показано как 3D-поверхности участка соответствующего района) в течение 300 s эксперимента. Редуктивной потенциал был применен между 60 s и 180 s. (Нижняя панель) соответствующий участок объемную интенсивность соотношения двух каналов ЮНИСТИЛ против времени. Зоны редуктивной потенциального применения затененные серым цветом. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Дополнительные файлы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить файлы.

Метод, описанный подходит для изучения Протон накачки дыхательных мембранных белков, которые могут быть преобразованы в липосомах и имеют возможность обмениваться электронов с бассейном хиноны. Протон, насосные деятельность может контролироваться на уровне сингл фермента, используя краски pH фактора (ratiometric), инкапсулированных в липосомы люмен (рис. 1A).

Метод основан на способности убихинон (или другие хиноны), включены в липидный бислой, обмениваться электронов с электродами, модифицированные с Сэм¹⁸. Свойства золота электрода, модифицированные с Сэм, очень специфичны. Липосомы нужно адсорбируются SAM и Сэм должен быть достаточно тонким, чтобы включить быстрый электрохимическое окисление и сокращение хиноны пула в липосомы. Важно отметить, что взаимодействие между электродом и липосомами должна быть достаточно слабый, чтобы не нарушить целостность липидные мембраны. Кроме того в зависимости от деталей экспериментальной системы, желательно если SAM предотвращает золото катализированное побочных реакций, таких как уменьшение кислорода. Наконец Сэм должен быть стабильным в пределах потенциальных окна используется. Использование ультра-плоские золотых электродов, модифицированные с высокого качества Сэм 6MH удовлетворяет этим требованиям в случае цитохрома Бо₃. Зачистки Золотые электроды из пластин кремния атомарным образом бемоль создает ультра-гладкую поверхность золота с почти идеальной Сэм, как спектров импеданса. Пожалуйста, обратите внимание, что мы формируем Сэм от 6MH в воде. Мы сообщалось ранее на Самс с 6MH в изопропиловый спирт¹⁶, но эти Самс exhibit более высокие значения-двухслойная емкость и спектров импеданса, которые указывают более неоднородной поверхности (т.е., более дефекты) с более низким сопротивлением. Кроме того, когда Самс от 6MH готовятся из водного раствора, уменьшение кислорода менее фон (за счет уменьшения золото катализируемой кислорода) наблюдается по сравнению с Самс формируется из этанола/изопропанол решения. Все эти наблюдения показывают, что Самс от 6MH в водных растворах имеют более высокое качество с меньше дефектов. Самс высокого качества также может быть сформирован из тиоловых соединений с более алканов цепи (например, 1-гидрокси Дечане тиоловых), но кинетика электронов передачи становятся медленнее, как Сэм толщина увеличивается.

Во время электрохимии (spectro) хлорид-ионов следует избегать в буферном растворе, поскольку они могут chemosorb на поверхности золота на высоких потенциалов, возможно ухудшение качества Сэм. По той же причине хлоридно свободный ссылка электрод следует отдать предпочтение.

Другим важным моментом является фон проницаемость липосом для протонов, которые должны быть достаточно низким, чтобы Протон накопление в результате ферментативных Протон транслокации на временной шкале эксперимента. Точное липидный состав может повлиять это проницаемость. В нашей работе, мы используем полярных E. coli липидов экстракты дополнена убихинон-10. Протонной проницаемости было показано сильно зависит от длины цепочки жирных кислот²⁵, хотя это противоречит в исследованиях с более сложным липидной композиции²⁶. Интересно, что убихинон недавно было показано для повышения стабильности мембраны²⁷. Наконец, остатков моющих средств от процедуры растворения белков может влиять Протон утечки и поэтому важно, чтобы как можно скорее, с использованием гидрофобных полистирола микрошарики, разбавление, следуют центрифугирования полностью удалить моющих средств и тщательное полоскание электрохимической ячейки после proteoliposomes адсорбироваться на поверхности. Если сомнения, липосомы проницаемость могут быть проверены следующие изменения рН люмен (через ЮНИСТИЛ) в ответ на внешние рН прыжок²⁸.

Измерения одного фермента требуют, что липосомы unilamelar и меньше липосомы, как ожидается, показывают изменения быстрее или выше рН как люмен объем уменьшается. Для достижения этой цели, полистирола микрошарики постепенно добавляют в небольших количествах, ведущих к медленные темпы формирования липосом. В таких условиях, образуются небольшие липосомы однородных размера со средним диаметром 70 нм и полиизопрена индекс 0,24 в нашем случае¹⁴. ЮНИСТИЛ также адсорбирует на полистирола микрошарики, снижение способности полистирола микрошарики для моющего средства. Следовательно следует добавить избыток полистирола микрошарики для компенсации своих потерь. Было отмечено, что лечение с полистирола микрошарики снизить концентрацию ЮНИСТИЛ в подвеске липидов белка, около четверти (от 5 мм до 3-4 мм). Однако фактическое ЮНИСТИЛ концентрация в просвете липосомы могут быть выше, поскольку липосомы формируются рано на лечение с полистирола микрошарики. Вместо ЮНИСТИЛ могут использоваться другие красители pH фактора. Однако, важно, что краска мембраны непроницаемый и ratiometric. Последний избегает экспериментальной ошибки из-за Фотообесцвечивание и различное количество инкапсулированные красителя.

Простые вычисления можно сделать для оценки ли, ковшах, большинство из non пустую липосомы содержат только одна молекула фермента. Предполагая, липосомы средний диаметр 70 нм, липидов молекулярной массой 750 да и зона липидов 0,65 нм² дает нам массу липосом 5.2x10^-17 g, то есть, 9.6x10¹³ липосомы за подготовку (5 мг липидов). На 0,1% от цитохрома Бо₃ (MW = 144 кДа), 2 x 10¹³ молекулы фермента присутствуют, соответствующих коэффициенту 0,2 белка: липосом. С помощью распределения Пуассона, одно может далее подсчитать, что вероятность найти одна молекула фермента (17%) в липосомы десять раз выше, чем вероятность найти более чем одной молекулы (1,7%). Более точные расчеты если учесть потери фермента и липиды во время растворения, определяется из соответствующих анализов. Последний может быть оценена из assay протеина и путем измерения флуоресценции FDLL подготовленных липосом.

Как только устанавливается протокол и одного фермента трассировки записываются, дальнейшие модификации метода возможно в зависимости от цели. Можно было бы подумать о добавлением ингибитора фермента или введение ionophore в систему. Следует позаботиться о том, чтобы убедиться, что добавлением растворителей, используемых для подготовки ionophore или ингибитор складе не влияют на состояние Сэма или проницаемость липосомы.

Техника, как описано здесь ограничивается определенной группы ферментов, которые являются мембраны Протон перевозчиков и хиноны преобразование. Оборудования и экспериментальных условиях здесь были оптимизированы для Ферментативная активность цитохрома Бо₃. Разрешение времени здесь, 2-3 секунды, определяется время экспозиции и время, необходимое для башни изменить фильтры. Продолжительность эксперимента ограничена Фотообесцвечивание флуоресцентных красителей и, таким образом, интенсивности света. Мы нашли ранее скорость средняя Протон транслокации цитохрома Бо₃ 73 ± 2,2 протонов/s, используя эту технику, хотя деятельность вплоть до 20 протонов/s были обнаружены. Чтобы использовать эти методы для ферментов с либо более или менее активности, параметров получения изображений должны быть адаптированы (т.е., света интенсивность, времени экспозиции и продолжительность эксперимента). В будущем этот метод может быть расширена за счет других переноса электронов вождения Протон накачки ферментов, например митохондриальной комплекс я. Другие ферменты могут потребоваться различные преобразование протоколов, и это будет нужно быть оптимизированы для каждой другой перевозчик. Протон насосы, которые не являются, хиноны преобразование ферменты также могут быть изучены, например, АТФ driven²⁹, хотя в этом случае Протон транслокации не может инициироваться электрохимически, но помимо инициатора (например, АТФ) не требуется. В последнем случае нет необходимости использовать золото модифицированные крышка выскальзования. Кроме того условии, что используется подходящий мембраны непроницаемый и Ион чувствительных Люминесцентную краску, этот метод может распространяться на другие ионных насосов, например, натрия и калия.

Авторы не имеют ничего сообщать.

Авторы признают СИББН (BB/P005454/1) для финансовой поддержки. NH финансировалась Программа следователь ВИЛЛУМ Фонд молодых.