Новый метод наложения швов теноррафи с тканевым коллагеновым трансплантатом для восстановления больших дефектов сухожилий

В этой статье мы представляем протокол in vitro и in situ для восстановления сухожильного промежутка до 1,5 см путем заполнения его инженерным коллагеновым трансплантатом. Это было выполнено путем разработки модифицированной техники шва для принятия механической нагрузки до тех пор, пока трансплантат не созреет в ткани хозяина.

Хирургическое лечение больших дефектов сухожилий с помощью сухожильных трансплантатов является сложной задачей, поскольку существует конечное количество участков, где доноры могут быть легко идентифицированы и использованы. В настоящее время этот пробел заполняется сухожильными ауто-, алло-, ксено- или искусственными трансплантатами, но клинические методы их защиты не обязательно переводятся на животных из-за масштаба. Чтобы оценить новые биоматериалы или изучить сухожильный трансплантат, состоящий из коллагена типа 1, мы разработали модифицированную технику шва, чтобы помочь поддерживать спроектированное сухожилие в выравнивании с концами сухожилий. Механические свойства этих трансплантатов уступают нативному сухожилию. Для включения инженерного сухожилия в клинически значимые модели восстановления нагрузки была принята стратегия разгрузки тканевого сухожильного трансплантата и обеспечения созревания и интеграции инженерного сухожилия in vivo до тех пор, пока не будет сформирован механически здоровый неотендон. Мы описываем эту технику, используя включение коллагенового типа 1 тканевой конструкции сухожилия.

Разрыв сухожилия может произойти из-за внешних факторов, таких как травматические рваные раны или чрезмерная нагрузка на сухожилие. Из-за внешних сил растяжения, приложенных к восстановлению сухожилий, неизбежно образуется зазор при большинстве методов восстановления сухожилий. В настоящее время дефекты сухожилий/промежутки заполняются ауто-, алло-, ксено- или искусственными трансплантатами, но их доступность конечна, а донорский участок является источником заболеваемости.

Тканеинженерный подход к изготовлению сухожильного трансплантата из природного полимера, такого как коллаген, имеет отличительное преимущество в том, что он биосовместим и может обеспечить жизненно важные компоненты внеклеточного матрикса (ECM), которые облегчают интеграцию клеток. Однако из-за отсутствия фибриллярного выравнивания механические свойства инженерного сухожилия (ET) уступают нативному сухожилию. Для повышения механических свойств более слабого коллагена использовались многие методы, такие как физическое сшивание под вакуумом, УФ-излучение и дегидротермические обработки^1. Также за счет химического сшивания с рибофлавином ферментативным и неферментативным методами повышается плотность коллагена и модуль Юнга коллагена in vitro^2,3. Однако при добавлении сшивающих агентов биосовместимость коллагена ставится под угрозу, так как исследования показали 33% изменение механических свойств и 40% потерю жизнеспособности клеток^3,4,5. Постепенное накопление выравнивания и механической прочности может быть получено за счет циклической нагрузки^6; однако это может быть эффективно приобретено in vivo⁷.

Для того, чтобы ET интегрировался in vivo и приобрел прочность без необходимости химического изменения, одним из подходов было бы использование стабилизирующей шовной техники для удержания более слабой конструкции на месте. Большинство ремонтов сухожилий полагаются на конструкцию шва, чтобы удерживать концы сухожилий вместе; следовательно, модификация этих существующих методов могла бы обеспечить логическое решение^8,9.

До 1980-х годов широко использовались 2-прядные ремонты, но в недавней хирургической литературе описывается использование 4 прядей, 6 прядей или даже 8 прядей в ремонте^10,11. В 1985 году Сэвидж описал методы 6-прядного шва с 6 точками крепления, и он был значительно сильнее, чем метод шва Баннелла, который использует 4 пряди ^12. Кроме того, 8-прядный ремонт на 43% прочнее, чем другие пряди в моделях cadaver и in situ, но этот ремонт не широко практикуется, так как становится технически трудно точно воспроизвести ремонт^13,14,15,16. Поэтому большее количество стержневых нитей шва связано с пропорциональным увеличением биомеханических свойств восстановленного сухожилия. Тем не менее, происходит потеря жизнеспособности клеток вокруг точек шва, и травма от чрезмерного наложения швов может быть в ущерб сухожилию, что может поставить под угрозу заживление сухожилия^17. Шовные методы должны обеспечивать сильное геометрическое восстановление, которое является сбалансированным и относительно неэластичным, чтобы свести к минимуму разрыв сухожилия после ремонта. Кроме того, расположение шва и его узлов должно быть стратегически размещено, чтобы они не мешали скольжению, кровоснабжению и заживлению до тех пор, пока не будет получено достаточное количество прочности^10,18.

Чтобы установить возможность обеспечения более слабого трансплантата ET или другого материала трансплантата между разорванным сухожилием, мы разработали новую технику шва, которая может разгрузить трансплантат, чтобы он мог созревать и постепенно интегрироваться в ткань хозяина in vivo.

ПРИМЕЧАНИЕ: Дизайн эксперимента и этическое одобрение были получены от Институционального наблюдательного совета UCL (IRB). Все эксперименты проводились в соответствии с постановлением Министерства внутренних дел и руководящими принципами Закона о животных (научная процедура) 1986 года с пересмотренным законодательством Европейской директивы 2010/63 / ЕС (2013). Кролики периодически осматривались названным ветеринарным хирургом (NVS) и два раза в день названным сотрудником по уходу за животными и благополучию (NACWO) (в соответствии с руководящими принципами и правилами Министерства внутренних дел). Они не проявляли никаких признаков боли, пока их не усыпили.

1. Подготовка тканеинженерного сухожильного (ET) трансплантата

1. Для изготовления гидрогеля коллагена добавьте 4 мл мономерного коллагена типа 1 крысиного хвоста (2,15 мг/мл в 0,6% уксусной кислоты с 0,2% мас./об.общего белка) и 500 мкл 10x Минимальной необходимой среды. Нейтрализуйте это, титруя против гидроксида натрия 5 M и 1 M и добавьте 500 мкл модифицированной среды Dulbecco Eagle Medium (DMEM).
2. Налейте 5 мл этого раствора в специально построенную прямоугольную металлическую форму (33 мм × 22 мм × 10 мм, вес 120 г)(рисунок 1). Храните форму в инкубаторе CO₂ при 37 °C и 5% CO₂ в течение 15 минут, чтобы обеспечить сборку матрицы^19.

2. Изготовление трансплантата

1. После полимеризации извлекают гидрогель коллагена из формы и помещают в стандартный пластиковый компрессионный узел(Рисунок 2А)^19.
2. Поместите коллагеновый гидрогель между двумя листами нейлоновой сетки по 50 мкм и приложите статическую нагрузку 120 г (общая площадь поверхности^{7,4 см2,}что является давлением, эквивалентным 1,6 кПа) в течение 5 минут для удаления интерстициальной жидкости из гидрогеля(рисунок 2А). Используйте четыре слоя фильтровальной бумаги для поглощения сбрасываемой жидкости из гидрогелей.
3. Используйте четыре слоя спрессованных гелей, свернутых друг на друга(рисунок 2B)и разрезанных на сегменты по 15 мм(рисунок 2C),чтобы изготовить ET.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментах использовались белые самцы новозеландских кроликов в возрасте 16 - 25 недель.
4. Седативные животные с внутримышечной (i.m.) дозой Гипнорма (0,3 мг/мл) и усыпляют путем введения передозировки пентобарбитона.
5. Сразу после эвтаназии подстригите волосы на обеих задних лапах. Затем с помощью хирургического лезвия размером 20 сделайте разрез 9 см вокруг нижней большеберцовой области, чтобы обнажить заднее сухожилие большеберцовой кости (TP).
6. С помощью хирургического лезвия того же размера иссекайте лапинные сухожилия TP средней длиной 70 мм и сохраняйте влажность в PBS во время экспериментального процесса, чтобы избежать высыхания.

3. Разработал новую технику теноррафии

ПРИМЕЧАНИЕ: Швы (см. Таблицу материалов)являются нерассасывающимися и изготовлены из изотаксического кристаллического стереоизомера полипропилена, который представляет собой синтетический линейный полиолефин. Основные взаимосвязанные швы в основном состояли из 3-0, а периферические швы были 6-0. Это были два основных шва, используемых во всех экспериментах.

1. Хирургическим лезвием отрежьте сухожилие ТП в средней точке. Вырежьте 15-миллиметровый сегмент сухожилия из середины сухожилия и замените его коллагеновым трансплантатом ET(рисунок 2D). Заблокируйте шов 3-0 проксимально от родных сухожильных концов(рисунок 3A).
2. Пройдите 3-0 стержневых швов по всей длине трансплантата и сцепитесь дистально от разрезанного конца.
3. Закрепите оба конца ET к нативному сухожилию с помощью 6-0 и непрерывных бегущих швов по периферии путем соединения двух концов сухожилия(рисунок 3B). Это делается для того, чтобы трансплантат можно было легко перемещать на шов, накладывая напряжение на родное сухожилие^20.
4. После закрепления шва, как описано выше, вручную убедитесь, что натяжение на швах является уместным и что нет вялости во всем шве.

Мы использовали коллагеновые трансплантаты, изготовленные из коллагена I типа, так как это преобладающий белок, обнаруженный в сухожилии. Он составляет почти 95% от общего количества коллагена в сухожилии; следовательно, коллаген обладает всеми идеальными свойствами для имитации сухожилия in vivo^21,22.

В этом исследовании использованный коллаген типа I был извлечен из сухожилия крысиного хвоста и растворен в уксусной кислоте (2,15 мг / мл). Чтобы полимеризовать этот коллаген, его нейтрализовали гидроксидом натрия in vitro, который образовывал несшитые анизотропные коллагеновые фибриллы. Этот гидрогель содержит 98% жидкости и может имитировать живую ткань in vivo в течение 20 минут во время изготовления^23. Однако этот гидрогель механически слаб; Поэтому для повышения механических свойств мы разработали метод быстрого сжатия гидрогеля коллагена методом, известным как «пластическое сжатие», где степень сжатия прямо пропорциональна приложенному весу сверху и высвобождаемой жидкости из жидкости, покидающей поверхность (FLS)^19.

Спиральное сворачивание этого трансплантата увеличивает его механические свойства^19,но трансплантат остается значительно слабее нативного сухожилия. Чтобы решить эту проблему, мы разработали новую модифицированную технику наложения швов, размещая точки шва не на краю разорванных сухожилий, а проксимально и дистально. Таким образом, прочность ремонта приходится на швы и точки швов, а не на механически более слабый сухожильный трансплантат.

Чтобы продемонстрировать функциональность разработанной новой техники шва, было иссечено лапинное сухожилие TP. Зазор был заполнен сухожильным трансплантатом длиной 15 мм, закрепленным швами 6-0, и 3-0 взаимосвязанных швов были размещены на 70 мм, чтобы действовать как барьеры нагрузки(рисунок 3A). Средняя прочность на разрыв ремонта составила 50,62 ± 8,17 Н, что было значительно выше(р< 0,05), чем у контрольного ремонта Кесслера 12,49 ± 1,62 Н(рисунок 4А). Следовательно, длина стержневого шва и их сцепление с концами сухожилия существенно влияют на сопротивление сухожилия и ремонту от разрушения при более высоких магнитозависимых силах^24,25.

Это сопротивление было недостаточным при контрольном ремонте, что привело к раннему отказу ремонта и отказу напряжения более 20% на сухожилии. Тем не менее, это физиологическая аномалия, так как сухожилия in vivo никогда не подвергаются 20% деформации из-за того, что не хватает места для сухожилия, чтобы простираться так сильно; Поэтому, чтобы проверить осуществимость модели шовной техники in vivo, мы выполнили ремонт in situ и рассчитали среднюю прочность на разрыв 24,60 ± 3,92 Н, что значительно выше контрольного среднего предела прочности на разрыв 13,98 ± 2,26 Н(рисунок 4B).

Рисунок 1:Нейтрализованный гидрогель коллагена (рН 7,4) (розовый цвет), отлитый в форме из нержавеющей стали. Гелю позволяли оставаться в инкубаторе_CO2 при 37 °C в течение 20 минут для возникновения фибриллогенеза. Шкала показана внизу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2:Процесс сжатия пластика. (A) Коллагеновый гидрогель, помещенный между нейлоновыми сетками с постоянной статической нагрузкой 120 граммов. Сливаемая жидкость впитывалась четырьмя слоями фильтровальной бумаги. Стрелка показывает поверхность жидкости, выходящей из теста (FLS) для геля. (B) Четыре слоя сжатых коллагеновых листов были свернуты вдоль оси с образованием «инженерного сухожилия» (ET). (C) Секция ET была разрезана на 15-миллиметровые сегменты, чтобы имитировать сухожилие. (D) Дефект сухожилия был создан в нативном сухожилии (NT) путем иссечения 15-миллиметрового сегмента заднего сухожилия большеберцовой кости, и дефект был заполнен ET. Эта панель была изменена по сравнению с предыдущей работой^26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3:(A) Дефект сухожилия был заполнен ET и закреплен швами 6-0, а техника сцепления четырех нитей 3-0 выполнялась путем прохождения над трансплантатом в области 30 мм. Стрелка блока показывает начальную точку для шва, а пустая стрелка показывает конечную точку шва. Эта панель была изменена по сравнению с предыдущей работой^26. (B) Осуществимость выполнения разработанной техники шва в пространстве внутри лапиновой модели(in situ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4:Механическая прочность. (A) Результат механического испытания при ремонте и (B) выход механического испытания in situ (полосы погрешности = SD; *p < 0,05, односторонняя ANOVA с поправкой Бонферрони). Эта панель была изменена по сравнению с предыдущей работой^26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В этом исследовании тканевые коллагеновые трансплантаты типа I были выбраны в качестве сухожильного трансплантата, потому что коллаген является природным полимером и используется в качестве биоматериала для различных применений тканевой инженерии^27,28. Также коллаген составляет 60% сухой массы сухожилия, из которых 95% составляет коллаген 1 типа ^{21,29,30,31,32.} Для успешного приживления механические свойства трансплантата должны идеально соответствовать нативному сухожилию^33; однако при современных инженерных методах механические свойства ET (4,41 N) значительно уступают нативному сухожилию (NT) (261,08 N)^33. Предполагается, что это связано с высокоорганизованным иерархическим расположением коллагеновой фибриллы в нативном сухожилии, которое остается проблемой для проектирования и соответствия его механическим свойствам^34. Мы попытались увеличить плотность ET-матрицы, применив статический вес сжатия к гидрогелю коллагена^33; однако архитектурная сложность, из которой сухожилие приобретает свою прочность, более сложна. Методы накопления механической силы, возможно, лучше всего достигаются in vivo,где биологические процессы хозяина могут действовать на ремоделирование внеклеточного матрикса. Поэтому в этом исследовании была принята другая стратегия для изменения текущей техники шва в качестве пост-сухожильного ремонта; механическая прочность восстановленного сухожильного трансплантата полностью зависит от шовной техники^8,9. Следовательно, изменяя существующие методы шовирования, мы можем разгрузить инженерный сухожильный трансплантат до тех пор, пока не произойдет ремоделирование клеток и ECM-индуцированных как новый подход.

На сегодняшний день существуют различные методы наложения швов для восстановления сухожилия, ни один из которых не является золотым стандартом; однако модифицированная техника шва Кесслера широко используется для восстановления сухожилий, поскольку она менее обструктивна и повреждает сухожилия^35,36. Сообщалось, что сухожилие мышцы сгибателя digitorum profundus ягнят при зашивании с помощью 6-прядной техники Savage имело силу разрыва 51,3 Н, но когда использовалась модифицированная техника шва Кесслера, сила разрыва составляла 69,0 N^7. Однако в этом исследовании, когда сухожильный зазор в 15 мм был заполнен ET и отремонтирован с помощью модифицированной шовной техники Кесслера, ремонт не удался на ранней стадии с прочностью на разрыв 12,49 Н(рисунок 4). Это низкое значение делает технику клинически неактуальной. Аналогичные результаты были сообщены De Wit et al. в модели сухожилия сгибателя свиней, предполагая, что ремонт Кесслера потерпел неудачу при разрыве шва, уменьшив разрыв на 15% по сравнению с крестообразным ремонтом, где разрыв уменьшается на 87%, а ремонт не удался при вытягивании шва^38. Таким образом, существует необходимость в другой прочной шовной технике, которая могла бы удерживать механически более слабый ET на месте.

Новая модифицированная техника шва была разработана с использованием четырех стержневых швов по всей длине ET и над противоположным сухожилием. Эти швы были прикреплены к самому шовному материалу на некотором расстоянии от каждого конца сухожилия. Это связано главным образом с тем, что сообщалось, что нанесение шовных узлов на равное расстояние и равное натяжение распределения нагрузки на все шовные нити повышает их механические свойства^39. Сбалансированное восстановление также может быть достигнуто путем сохранения непрерывного шва и ошеломляющего ремонта, чтобы обеспечить компрессию на месте ремонта^40.

В этом исследовании 3-0 швов были использованы для наружных сцепленных швов, учитывая, что сухожилие TP кролика имеет длину, ширину и толщину 62,4 мм, 5 мм и 1,5 мм соответственно. Швы 6-0 использовались для удержания инопланетян на месте. Хотя мы пробовали другие рассасывающиеся шовные материалы, это было бы неуместно, так как они становятся слабее в течение периода in vivo^41. Основная причина, по которой были выбраны полипропиленовые швы, заключается в том, что они являются монофиламентными, а также нерассасывающимися и не вызывают структурных или натяжных модификаций под нагрузкой^42. Мы проверили все швы от 2-0 до 7-0, но 3-0 и 6-0 оказались идеальными кандидатами для наших экспериментов ^26.

Основной причиной использования 4-х нитей было предотвращение чрезмерного повреждения разорванных окончаний сухожилия с большим количеством шовных нитей, поскольку сообщалось, что нормальный хирургический шов в сухожилии приводит к образованию бесклеточной^{области 43.} Было выдвинуто предположение, что это связано с тем, что клетки мигрируют от сжимающей нагрузки, которая возлагается на сухожилие, и обычно эти клетки подвергаются растягивающей нагрузке^17. Эта миграция клеток от шва может затем вызвать ослабление матрицы, поскольку существует нехватка клеток для поддержания и оборота матрицы, что может привести к раннему отказу сухожилий^17. Мы можем использовать больше прядей швов, которые биомеханически в два раза прочнее(ex vivo), чем 4-прядные швы^11,12,44,45; однако эти ремонтные работы не получили широкого распространения, и их клинические ограничения в настоящее время оцениваются^13,14,15,16.

Размещение шовного узла важно, но есть аргументы за и против экстернализации шва. Наличие шва на внешней поверхности может потенциально зацепиться за такие структуры, как сухожильные шкивы, и уменьшить скольжение. В исследовании области, где швовые узлы размещены внутри, проиллюстрировали снижение сопротивления скольжению по сравнению с ремонтом Кесслера, который имеет шовные узлы снаружи^46. Исследования, проведенные в собачьей модели, пришли к выводу, что при более высокой величине силы сохранилось меньше шовных узлов, расположенных вне ремонта и вдали от сухожильных концов, по сравнению с теми, которые расположены внутри ремонта^47,48. Однако интернализация узла потенциально уменьшает контактную поверхность заживающего сухожилия. Существует также мнение, что повреждение тканей возникает из-за того, что шовная игла прокалывает сухожилие, и большее количество проходов относится к увеличению травмы сухожилия^49.

Чтобы закрепить ET между сухожильным зазором, был выполнен стандарт бегущих швов⁵⁰ вдоль края сухожилия и ET. Это было сделано потому, что была потребность в периферических швах, которые достаточно прочны, чтобы удерживать ET на месте в начальной фазе заживления до тех пор, пока не произойдет ремоделирование клеток и ECM-индуцированных^50. Основной проблемой было изменение механических свойств NT и ET, что могло привести к раннему образованию разрыва, хотя ET был экранирован напряжением. С другой стороны, нанесение более надежной техники, такой как горизонтальный матрас интраволоконным швом^51,halsted непрерывные горизонтальные матрасные швы^52,53,вышивка крестиком эпитендинозные методы ремонта^54,55,56,57 или бегущие швы замка^58,59 разорвал бы инопланетянина, так как она хрупкая. Таким образом, мы выбрали бегущие швы в качестве периферической шовной техники, которая проста и удерживает ET неповрежденным во всех направлениях.

С точки зрения тканевой инженерии нам нужно изучить, можно ли использовать этот метод для заполнения сухожильного промежутка более 1,5 см. Чтобы использовать этот трансплантат в клинических испытаниях на людях, нам необходимо дополнительно исследовать иммунологический ответ на ксеногенный источник коллагена, хотя это может быть достигнуто путем разработки коллагена клинического класса. Протокол, описанный в настоящем описании, устанавливает осуществимость разработанного метода шва в пределах доступных анатомических пространств в модели лапина свиньи. Эта разработанная техника шва имеет точки шва проксимально и дистально равноудаленное расстояние от разорванных концов сухожилия, так что инженерный сухожильный трансплантат может быть разгружен. Следовательно, он может созреть и интегрироваться in vivo.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Авторы хотели бы поблагодарить UCL за финансирование этого проекта.