Изоляция эндотелиальных клеток человека от обычной толстой кишки и колоректальный рак - улучшение протокол

Эндотелиальные клетки опухоли являются важными факторами, определяющими микроокружения опухоли и течения заболевания. Здесь описывается протокол для изоляции чистой и жизнеспособной эндотелиальных клеток человека колоректальные карциномы и нормальной колон для использования наркотиков испытания и патогенез исследований.

Первичные элементы изолированы от человеческого карциномы являются ценными инструментами для выявления патогенетических механизмов, способствующих развитию болезни и прогрессии. В частности эндотелиальные клетки (ЕС) представляет собой внутреннюю поверхность сосудов, непосредственно участвовать в доставки кислорода, питательных и удаления отходов в и из опухоли и таким образом широко участвуют в Конституции опухоли микроокружения (ТМЕ). Эндотелиальные клетки тумора (СППП) может использоваться как сотовой биодатчики внутриопухолевых микроокружения, учрежденной взаимодействие опухоли и стромальных клеток. Тик также служить цели терапии. Соответственно в культуре эти клетки позволяют исследования механизмов реагирования или резистентности к лечению анти ангиогенных. Недавно было обнаружено, что тик изолированы от человеческого колоректальные карциномы (CRC) выставка памяти подобных эффектов на основе конкретных TME, они были получены от. Кроме того эти тик активно способствовать созданию определенного TME путем секреции различных факторов. К примеру тик в прогностически благоприятным Th1-TME выделяют анти ангиогенных опухоли подавляющих факторов выделяется белка, кислой и богатые цистеином как 1 (SPARCL1). SPARCL1 регулирует судно гомеостаза и подавляет пролиферацию опухолевых клеток и миграции. Следовательно культуры чистого, жизнеспособных тик, изолированы от человеческого солидных опухолей являются ценным инструментом для функциональных исследований о роли сердечно-сосудистой системы в tumorigenesis. Здесь описан новый современный протокол для изоляции первичных ЕК от обычной толстой кишки, а также CRC. Методика основана на механические и ферментативные ткани пищеварение, immunolabeling и клеток активированных флуоресцированием сортируя (FACS)-Сортировка тройной положительных клеток (CD31, ве Кадгерины, CD105). С настоящим Протоколом, жизнеспособных TEC или нормальной эндотелиальных клеток (NEC) культур может быть изолирован от тканей толстой кишки с успеха 62,12% при сортировке СУИМ (41 чистой культуры ЕС от 66 образцов тканей). Таким образом этот протокол обеспечивает надежный подход к изолировать человека EC культур от обычной толстой кишки и CRC.

Микроокружения опухоли (ТМЕ) определяется как тесное взаимодействие опухолевых клеток с опухоли стромы, которая состоит из клеток, таких как эндотелиальных клеток (EC), pericytes, фибробласты, гладкомышечные клетки или клетки иммунной системы. Связь между этими отсеками сотовой может управляться паракринными факторов (например, ангиогенных факторов роста, цитокинов), внеклеточного матрикса, или прямой ячеек контакта. Отсеке стромы может содействовать или противодействовать опухоли посвящения или прогрессии, в зависимости от конкретных TME создана.

Способность опухоли соединиться с системой судна является ключом к прогрессии и метастазированием болезни. Система судна позволяет опухоль преимущественно для того получить доступ к доставки кислорода и питательных веществ, а также удаления отходов^1,2,3. EC составляют внутреннюю поверхность сосудов и поэтому важных клеточных компонентов, которые активно участвуют в этом процессе. Это хорошо известно, что эндотелиальные клетки тумора (TEC) отличаются от их соответствующего нормального эндотелиальных клеток (NEC), многие функции, такие как нарушается иерархии сосудистой дерева, судно негерметичности, или сократить созревания, о чем свидетельствует сокращение числа pericytes/настенная клетки, которые только слабо прикреплены к ЕС⁴.

Следовательно тик являются ценные сотовых инструменты для изучения канцерогенеза. Тик рассматривались главным образом для укрепления роста и прогрессии опухоли³. Таким образом тик может использоваться как биосенсоры, которые позволяют мониторинга и идентификации болезнетворных процессов, которые инициировать, поощрять или противодействовать tumorigenesis. Кроме того они являются терапевтических целей в клинике⁵. Следовательно изолированных тик и соответствующие НПВ может также использоваться как инструменты для понимания механизмов реагирования или резистентности к лечению анти ангиогенных.

В прошлом мы разработали протокол, чтобы изолировать эти клетки^6,7 и определили, что тик отличаются не только от NECs, но также отличаются друг от друга в зависимости от TME, они были получены от⁸. Применяя этот подход было показано что тик в некоторых TMEs может активно противодействовать опухолевого роста и прогрессии секрецию анти ангиогенных опухоли подавляющие белков, таких как SPARCL1. Это свидетельствует, что тик, активно способствуют созданию прогностически благоприятным TME в человека колоректальные карциномы (CRC)⁸.

Предыдущие исследования пытались изолировать человека тик от солидных опухолей. Важной целью этих исследований было, например, выявление новых опухоли эндотелиальных клеток маркеры (TEMs)⁹. Стратегия немедленного использования тик после лазерной microdissection был применен для того, чтобы избежать изменения или утраты фенотип TEC в культуре. Однако последующие исследования выявлены загрязняющих населения росписи клеток как серьезный недостаток этого подхода-¹⁰. Наши лаборатории был первым разработал протокол, который позволяет изоляции чистой, жизнеспособных тик от человека CRC пациентов^6,7. Был выбран подход с нескольких магнитных ячейки выбор (ПДК) раундов тик, которые обеспечивают высокой чистоты изолированных EC культур. Однако этот подход требует относительно длительного культивирования период (6 недель в среднем), что повышает риск памятников культуры индуцированной. Таким образом на следующем шаге, цель – сократить культивирование время между хирургии и урожай первых чистой культуры. Для достижения этой цели, улучшенная протокол, используя комбинированные механические и ферментативные на основе ткани диссоциации первоначальной опухоли, следуют клеток активированных флуоресцированием сортируя (FACS)-Сортировка тройной меченых EC, была разработана. Это сократило время изоляции в среднем до трех недель, что приводит к чистой TEC и NEC культур с повышенной жизнеспособности для функциональных исследований. Изоляции чистого жизнеспособных TEC и NEC культур из человеческих тканей с высокий уровень успеха могут открыть новые возможности для пациента конкретных наркотиков испытаний во время разработки схем индивидуализированные терапии. Изоляции подход приводится в нижеследующих пунктах.

Процесс изоляции был одобрен местной Этический Комитет Университета Эрланген медицинский центр (#159_15 Б, TuMiC исследование). Критерии включения пациентов были следующие: CRC, UICC этап-IV, без истории воспалительные заболевания кишечника и лечение не неоадъювантной.

1. хирургии и подготовка ткани для одной ячейки изоляции

1. Получение образца хирургическим путем от больного CRC (карцинома ткани > 0,5 г, Центральный-некротическими опухоли; нормальных тканей толстой кишки > 10 см далеких от опухоли).
2. Части полученных ткани в основном < 1 g для рака, но > 1 g для нормальной толстой кишки. Если куски > 1 g получаются, разделить их на несколько частей 1 g, используя свежие скальпеля для дальнейшей обработки ткани.
   Примечание: Если кусок ткани опухоли ниже 0,5 г с самого начала, изоляции обычно происходит сбой.
3. Собирать свежие незафиксированные куски ткани, с помощью стерильный пинцет в 40 мл холодной Хэнкс сбалансированного солевого раствора (HBSS) с пенициллином/стрептомицина/Амфоторецина B льда (1% HBSS-перо/воспаление/ampho) в 50-мл пробирок и передавать их быстро Лаборатория.
   Примечание: Тканей толстой кишки часто сильно загрязненных с бактерий/грибов с самого начала. Во время всей процедуры изоляции перо/воспаление/ampho должны быть добавлены ко всем решениям для того, чтобы ликвидировать вредные организмы.
4. Мыть каждый кусок ткани, по крайней мере 4 раза с 40 мл лед холодной HBSS-перо/воспаление/ampho (см. шаг 1.3) в 50-мл пробирок путем передачи части ткани последовательно от одного пластиковых пробирок следующего трубки с помощью стерильный пинцет.
   1. Чистые пинцет после каждого шага с 70% этиловом спирте.
   2. Используйте отдельные щипцы для карциномы и нормальной кусочки тканей толстой кишки.
   3. Взвесьте все кусочки ткани.
      Примечание: Не ставьте куски ткани непосредственно на шкалу для взвешивания. После мытья, весят последний пластиковых пробирок, содержащий ткани до и после ввода кусочки ткани. Рассчитайте вес отдельных тканей путем вычитания.

2. поколение одноклеточного подвеска

Примечание: Рекомендуется сохранить ткани, увлажненной во все времена.

1. Если он существует, удалите прилагаемый fat, другие неопухолевых ткани или потенциально некротических тканей частей из образца операции путем передачи части ткани в стерильных клетки культуры Петри с помощью стерильный пинцет.
   1. Держите кусочки ткани, увлажненной на все времена, добавив 3-5 мл HBSS-перо/воспаление/ampho.
   2. Срежьте кусочки ткани, используя свежие стерильным скальпель (рис. 1). В случае идентификации ткани является неясным, проконсультироваться с патологоанатом.
2. Фарш оставшиеся ткани на мелкие кусочки (примерно 2 × 2 × 2 мм³) используя свежие скальпеля с изогнутое лезвие. Передача части ткани стерильным пинцетом в ткани диссоциации трубы (например, gentleMACS C трубы) предварительно заполнены с подогретым (37 ° C) клеток культуры среднего (Dulbecco´s изменение орел средних [DMEM] Базальные среднего) согласно данным производителя инструкции.
   Примечание: Попробуйте использовать скальпель как тряся инструмент. Не выжимать клетки во избежание повреждения тканей.
3. Дайджест/отделить ткани куски с помощью ткани диссоциатором (как gentleMACS Octo диссоциатором) в сочетании с комплектом диссоциации опухоли для человеческой ткани, с помощью программы «37C_h_TDK_1» после manufacturer´s инструкции.
4. Центрифуга диссоциации трубы 1 мин на 300 x g при комнатной температуре (RT).
5. Добавить 10 мл подогретым (37 ° C) DMEM дополнена 0,5% плода бычьим сывороточным (ФБС) (DMEM-низкий) для каждой трубы, используя Серологические Пипетки и фильтрации суспензии клеток с помощью стрейнер ячейки (размер пор 100 мкм) на вершине 50 мл пластиковых пробирок, закупорить ячейки подвеска на верхней части фильтра.
6. Снова добавьте 10 мл DMEM-низкий для каждого MACS-трубка с Серологические Пипетки и передать оставшиеся клетки клетки ситечко на вершине 50 мл пластиковых пробирок.
7. Мойте фильтр клетки один раз с еще 10 мл DMEM-низкий средний уровень с помощью Серологические Пипетки.
8. Центрифуга суспензию клеток для 7 мин на 300 x g в RT и удалить супернатант.
9. Ресуспензируйте клетки в 5 мл подогретым эндотелиальной базальной среды (МВБ) -2-Микроваскулярная (MV) средний (лонза) дополнены с пером/воспаление/ampho в том же 50 мл пластиковых пробирок.
10. Суспензию клеток в плиты в колбе культуры клеток T-25, предварительно покрытием на ночь с 1,5% желатина-фосфатный буфер (PBS) при 37 ° C с 5% CO₂.
11. Инкубации клеток для 24 ч при 37 ° C и 5% CO₂, мыть два раза клетки тщательно с приблизительно 5 мл PBS и добавьте 5 мл свежей среды.
12. Культивируйте клетки при 37 ° C и 5% CO₂ до 80-90% confluency (обычно 5-7 дней) с интервалом 48 ч среднего обновления.

3. СУИМ сортировка эндотелиальных клеток

Примечание: Попробуйте избежать потери клеток в любой точке, например , ограничив пятная процедуру для инкубации клеток в одном реагент трубку.

1. Отсоединить клеток в 1 мл accutase (примерно 10 минут) и добавить 4 мл среды EBM-2-MV подогретым (37 ° C).
2. Определите количество клеток с помощью автоматизированных ячейки, подсчет устройство (диапазон 10-25 мкм).
3. Центрифуга суспензию клеток для 4 мин с 250 x g в RT и удалить супернатант.
4. Ресуспензируйте клетки в подогретым СУИМ буфера (ПБС, 2,5% альбумина bovine сыворотки [BSA], 5 мм ЭДТА рН 8,0, 10 мкм Y-27632) по количеству клеток (5 х 106/мл).
5. Добавить СУИМ Пятнать антитела согласно объем ячейки фото/FACS-буфера: CD31-FITC (100 мкл/мл = 1/10), CD144/сосудистого эндотелия (VE) - Кадгерины - PE (100 мкл/мл = 1/10), CD105-APC (25 мкл/мл = 1/40), смешать и проинкубируйте 7 мин на RT, защищенном от света; Осторожно проведите и инкубировать еще 8 мин (за время всего инкубации 15 мин).
6. Добавьте 2 мл СУИМ-буфера подвеска меткой ячейки, используя Серологические Пипетки.
7. Центрифуга для 4 мин с 250 x g в RT и удалить супернатант.
8. Мыть два раза, добавив 2 мл СУИМ-буфера и проводить последующие центрифугирования по 4 мин на 250 x g в RT и удалить супернатант.
9. Ресуспензируйте клетки в 500 мкл подогретым EBM-2-MV-перо/воспаление/ampho и передачи клетки инструмент сортировки СУИМ.
   1. Эндотелиальные клетки быстро умрет во время процесса сортировки, если СУИМ инструмент охлаждается. Таким образом выполнять сортировку эндотелиальных клеток в RT и немедленно передать собранные клетки инкубатора 37 ° C потом.
      Примечание: СУИМ инструмент обычно нестерильные!
10. Сортировка/сбор тройной положительных клеток прямо в ячейку культуры блюдо (например, 24-а латы, предварительно покрытием на ночь с 1,5% желатина PBS) заполнены с 0,5 мл подогретым свежей среды (дм-2-MV-перо/воспаление/ampho).
    Примечание: Проверьте суспензию клеток после сортировки с помощью микроскопа. Если клетки кластера вместе, постарайтесь получить равномерное распределение клеток в клетки культуры блюдо смешивая их медленно или добавляя среднего.
11. Культивировать клетки до 90-100% confluency с интервалом 48 ч среднего обновления и расширения клетки на размер желаемого культуры блюдо (24-ну пластины → 12 → ну пластины 3,5 см блюдо → T-25 → T-75).

4. урожай и характеристика чистого эндотелиальных клеток

1. Урожай клетки на 90-100% confluency и характеризуют их соответствующим методом (например, FACS, цитохимии, количественные полимеразной цепной реакции (ПЦР) или эндотелиальных клеток функции анализов^7,8).
2. Анализируйте изолированных клеток с какой характеристика метод выбран.

Изоляции NEC и TEC от человека CRC, комбинированный механический/enzymatical ткани диссоциации, следуют последующих CD31/CD105/VE-Кадгерины driven СУИМ сортировка описан здесь (рис. 1А). Этот протокол представляет собой улучшенный протокол с окном сокращение времени до первого урожая чистой, жизнеспособных эндотелиальных клеток по сравнению с предыдущей протокол на основе MACS⁷.

NEC и ПИС были изолированы от человека CRC, используя следующие шаги: (1) поколения подвеска одну ячейку путем комбинированных механических и ферментативные ткани диссоциации и рост этих клеток к confluency 80-90% (рис. 1), (2) тройной маркировки ЕС CD31/CD105/VE-Кадгерины сочетании флюрохром антител, и (3) сортировки СУИМ соответствующих тройной положительных клеток(рис. 2). Следует отметить, важным шагом для успех процедуры изоляции и жизнеспособность клеток является быстро тема хирургии образца к процедуре изоляции (поколение одноклеточного подвеска < 1 час после резекции). Использование СУИМ сортировка, среднее 12.500 TEC (n = 12) и 17 800 NEC (n = 12, рис. 2B, слева) составляет в среднем 3,6 и 5,6% населения всего клеток (рис. 2B, справа) может быть изолирован. Впоследствии клетки были расширены до T-75 (называемых проход 1) и собранного или дальнейшей обработки для анализа. Следует отметить, используя предыдущий протокол на основе MACS, средняя изоляции 49,6% успех (n = 58 чистого тик от n = 117 пациентов⁸) с чистой EC культурах имеющиеся в среднем 6 недель после операции. С помощью нового протокола на основе СУИМ описано здесь, первый чисто EC культур были получены в среднем 3 недели после операции с изоляции успеха 62,1% (n = 41 чистых культур EC, полученные из n = 66 одной клетки суспензий, подвергаться сортировке СУИМ). Таким образом увеличение уровня изоляции на 12,5% был достигнут параллельно с уменьшением объема культивирования времени от 6 до 3 недель. Это сокращение культивирования времени привели к жизнеспособности улучшение клеток и длительной продолжительности жизни сопровождается меньше подвержение к индукции потенциальных артефакты культуры-зависит от установленных культур.

Характеристика EC чистоты был проведен первый CD31-цитохимии (рисA). Если культур были лишены CD31-отрицательные клетки (рис. 3A, ПИС и NEC), они были подвергнуты более подробных клеток, набрав обратной транскрипции количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР RT) (Рисунок 3B). Тип ячейки конкретных Праймеры для ЕС (фактор [vWF] CD31, CD105, ве Кадгерины и Виллебранда), лейкоцитов (CD45), эпителиальных клеток (Цитокератины [CK] -20) и гладкомышечные клетки/фибробластов (десмин) были использованы (рис. 3B). С помощью этой ячейки на основе ПЦР, набрав, потенциальное загрязнение EC культур на другие ячейки в диапазоне 0,1 - 2%, в зависимости от типа клеток, могут быть обнаружены⁸.

В частности мы сообщалось ранее преференциального потери vWF выражения протеина в TEC культур по сравнению с их соответствующих культур NEC⁷. Эти выводы могут быть подтверждены с недавно созданной изоляции протоколом (рис. 3C, означает потерю NEC-TEC Ct = 0.687, p = 0.173, паре t тест). Культур, успешного прохождения контроля эти качества были протестированы микоплазменной инфекции и впоследствии используется для дальнейших экспериментов.

Рисунок 1 : Чисто эндотелиальные клетки могут быть изолированы от человека нормальный Колон и CRC сортируя СУИМ. (A) схема основных этапов процесса изоляции ЕС. (B) жировой ткани (желтый), другие неопухолевых частей, или потенциально некротических тканей частей (коричневый) были удалены из образца хирургии (левой и средней панели) и опухоль была распался кубиками размером 2-3 мм длина стороны до (диссоциация) ткани Правая панель). (C) одну ячейку подвеска восстановлены после ткани диссоциации (левая панель) был инкубированы для 24 h блюдах культуры клеток. Впоследствии, не сторонник клетки были удалены мягкий мытья с использованием PBS (средняя группа) и клетки были выращены в 80-90% confluency до сортировки СУИМ (правая панель). Изображения нижней панели (C) были приобретены фазово-контрастной микроскопии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : В среднем 3,6-5,6% подвески одной ячейки изолированы от человеческого CRC пациентов и сортировка по СУИМ были EC. тройной позитивных (A) NEC и ПИС были СУИМ сортировка с помощью тройной маркировки клеток с анти CD31, - CD105 и - VE-Кадгерины антител. (B) A среднее 12.500 тик (n = 12) и 17 800 НПВ (n = 12) могут быть изолированы от человеческого обычной толстой или CRC, использование СУИМ Сортировка (CD31, CD105 и ве Кадгерины положительных клеток, левая панель), который представляет в среднем 3,6 и 5,6% (правая панель) общей ячейки Население занято. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : NEC и TEC от человека CRC Экспресс типичный эндотелиальных клеток маркеров. Нормальные клетки эндотелия Колон (NEC, n = 10) и эндотелиальных клеток опухоли (TEC, n = 10) от человека КПР являются CD31 (EC маркер)-, CD105 (EC маркер)-, ве Кадгерины (EC маркер)-, vWF (EC маркер) - позитивные и CK20 (CRC ячейки маркер)-, десмин (фибробластов/SMC маркер)-, CD45 ( лейкоцита маркер)-минус определяется (A) CD31-immunocytochemistry (позитивных клеток = red) и (B) RT-ПЦР (точек данных ниже пунктирной линии являются образцы обнаружены быть отрицательным). (C) vWF выражение определяется RT-ПЦР для соответствующего ПИС/NEC образцов из тех же больных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Главным образом три различные методы применялись до настоящего времени изолировать чистой и жизнеспособной НПВ и тик от твердых тканях человека, а именно обогащение (1) иммуномагнитная, (2) лазерный microdissection и (3) СУИМ сортировка EC дроби. В большинстве публикаций иммуномагнитная обогащение клеток после поколения подвески одной ячейки путем механического распад был используется^11,12,13. К примеру, иммуномагнитная очистки из человека дермального микрососудистой ЕС (HDMEC), E-селектина антител после фактор некроза опухоли (ФНО)-α лечение новорожденных иммунохимические¹³ было сообщено для изоляции человека ЕК от глиомы ткани Дайджест, percoll градиент и выделение с помощью анти CD31/CD105 и¹²VE-Кадгерины антитела, или путем антител анти CD105 от человека груди Рак¹¹. Протоколы, которые применяют Лазер microdissection или сортировка СУИМ сообщалось реже. Лазерная microdissection был использован, например, для выявления потенциальных Пан опухоль эндотелиальных клеток маркеры (TEMs) в ЕС, полученных от человека колоректальный рак с анализа клеток сразу после вскрытия⁹. СУИМ сортировка с использованием анти CD31-антител был успешно продемонстрировали для изоляции EC дроби от недифференцированных эмбриональных человека стволовых клеток¹⁴.

Эти подходы имеют различные преимущества и недостатки, которые должны быть рассмотрены. Преимущества для подхода, основанного на иммуномагнитная, что требуется не разработка оборудования, выбор может проводиться в любое время, и обогащение клеток быстро (примерно 15 мин) по сравнению с СУИМ Сортировка (примерно 1 час). Отсутствие матрицы для более длительного периода времени может вызвать гибель клеток ЕС по anoikis. Таким образом добавлением ингибитора киназы Ро Y-27632 буфер СУИМ была применена для предотвращения клетки anoikis¹⁵.

Недостатки иммуномагнитная обогащения, что несколько раундов выделения требуется для достижения чистоты выше 99%. Кроме того культивирования клеток между обогащения необходим для восстановления клеток, который увеличивает возраст культур, поддержку культуры индуцированной артефактов. Лазерная microdissection имеет то преимущество, что клетки могут быть использованы немедленно который уменьшает культуры индуцированной артефактов, но включает в себя риск заражения клеток от прилегающих тканей районах¹⁰. Кроме того microdissection не устанавливается в каждой лаборатории. Недостатки подхода на основе сортировки СУИМ включают, похож на лазерные microdissection, что оборудование сложных и дорогостоящих. Соответственно данное оборудование не может быть доступна в любое время. В клинических условиях, где наличие ткани интерес не может планироваться точно, это может добавить еще один недостаток.

Однако основные преимущества СУИМ сортировка, что фракция EC могут быть помечены несколько антителами параллельно. Таким образом могут быть использованы строгие стробирования стратегию, которая обеспечит высокую чистоту. Основываясь на опыте, повторной сортировки фракции ЕС требовалось, в отличие от предыдущих MACS-протокол на основе где пришлось использовать несколько раундов выделения. Это привело к значительному сокращению культивирования время до чистоты от шести недель (MACS подход) до трех недель в СУИМ подход, что приводит к жизнеспособности улучшение клеток, что позволяет длительное время окно анализа. Наконец, использование СУИМ сортировка-на основе стратегии, улучшение общего успеха изоляция может быть достигнута (увеличение 12,5%). В заключение СУИМ сортировка основе стратегии найма 3 антител параллельно после дайджест ткани путем комбинированных механических и ферментативные ткани пищеварение имел многочисленные преимущества, которые установили этот протокол как метод выбора для изоляции тик и NECs от человека карциномы прямой кишки и толстой кишки.

Авторы заявляют, что они имеют не конкурирующие интересы.

Мы благодарим Кристиан Flierl, Петтер Katja, Кристина Schnürer (все отдела молекулярной и экспериментальной хирургии), Уве Аппельт, Майкл Мроз (основной блок СУИМ-сортировка) и Симон Völkl (основной блок СУИМ-иммуномониторинга) за отличную техническую помощь. Эта работа была поддержана грантов EN/МС междисциплинарный центр клинических исследований (IZKF) из Университета Эрланген медицинский центр, Немецкий исследовательский фонд (DFG: для 2438, SP2) и Лутц-Stiftung, Грант Роберт-Pfleger-Stiftung к VSS, а также гранты для MS от немецкого фонда научных исследований [DFG: KFO257 (подпроекта 4), SFB 796 (подпункт проекта B9)].