Количественные и качественные метод сфингомиелин, LC-MS, с использованием двух стабильных гетерогенны помечены виды сфингомиелин

Здесь мы представляем протокол для количественного определения и квалификацию каждого вида сфингомиелин, используя несколько мониторинг реакции и МС/МС/МС режим, соответственно.

Мы представляем метод анализа сфингомиелин (SM) качественно и количественно жидкого хроматографии электроспрей ионизации тандем масс-спектрометрия (LC-ЭСИ-МС/МС). SM является общей Сфинголипиды, состоящий из фосфорилхолин и Церамид как компонент гидрофильные и гидрофобные, соответственно. Ряд видов SM присутствуют в клетках млекопитающих из-за разнообразия в сфингоидные длинной цепи базы (LCB) и N-ацил группу в составе Церамид. В настоящем докладе, мы показываем метод оценки количество углерода и двойных связей в LCB и N-ацил группу на основе их соответствующего продукта ионов в экспериментах MS/MS/MS (³МС). Кроме того мы представляем метод количественного анализа для SM с использованием двух стабильных гетерогенны помечены SM видов, что облегчает определение диапазона, используемые в SM количественный. Нынешний метод будет полезным при характеристике различных видов SM в биологических образцов и промышленных продуктов, таких как косметика.

Сфингомиелин (SM) является общим Сфинголипиды в mammalian клетках. SM-синтезированных внутриклеточно¹ и настоящего как прекурсор для других Сфинголипиды, такие как сфингозин-1-фосфата и керамиды, которые имеют решающую роль в иммунной клетки оборота и кожи барьер гомеостаза, соответственно^{2, 3}. Таким образом точный анализ метаболизма SM имеет важное значение для выяснения роли физиологических и патологических Сфинголипиды.

SM состоит из церамида и фосфорилхолин, что связано с 1-гидрокси группы Церамид, которая также состоит из сфингозин и N-ацил остаток. Различные количества углерода и двойную связь в сфингозин и N-ацил общие результаты количество Церамид (и SM) видов. Последние достижения в LC-ЭСИ-MS/MS позволило количественный и качественный анализ SM^4,5. В качественном анализе количество углерода и двойные скрепления сфингоидные LCB SM была определена путем назначения продукта Ион спектры LCB. Однако структурная информация N-ацил остаток не было получено непосредственно, потому что его соответствующего продукта ионов не сообщалось и поэтому N-ацил постановление были выведены дифференциального анализа между ионами прекурсоров и ионы продукт, соответствующий LCB в обоих режимах положительных и отрицательных ионов^4,5. В настоящем докладе, мы представляем метод для обнаружения продукта ионов LCB и N-ацил группу одновременно в режиме³ МС, с помощью тройной квадрупольного и квадрупольного линейной ионной ловушки масс-спектрометрии, который облегчает точное структурных спекуляции каждого вида SM⁶.

Ион подавления (или повышение) эффекты, вызванные матрицы в биологических образцах затрудняют точную количественную оценку в анализе LC-ЭСИ-MS, и поэтому, желательно строить калибровочные кривые для всех аналитов интерес в матрице идентичные в биологическом образце. Однако эта стратегия не возможно, потому что это почти невозможно для подготовки всех видов SM в биологических образцах, особенно в всеобъемлющего анализа. Таким образом это практично для построения калибровочной кривой и определения количественного диапазона с помощью представительных видов SM шипами в биологических образцах. Мы использовали два вида гетерогенны помечены SM для построения калибровочной кривой; один был использован для внутреннего стандарта и другой для соединения стандарта. Мы обнаружили небольшое количество гетерогенны помечены SM видов как стандартное соединение с шипами в биологических образцах и успешно получил калибровочной кривой и количественного диапазона⁶.

Консультации все соответствующие листы данных безопасности материалов (MSDS) перед использованием. Надевайте перчатки, чтобы свести к минимуму загрязнение образцов кожи производные SM. Настоящий Протокол применяется к клетки HeLa, выращенных в орла минимальных основных средних дополнена 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 2 мм L-глютамин, 1.000 U/L пенициллина и стрептомицина 100 мг/Л.

1. подготовка проб липидов

Примечание: Важно, что все стекла, включая пробирки с тефлоновым покрытием колпачки быть моющих средств бесплатно.

1. Извлечение общего Липидные фракции из клеток огневки, используя метод Bligh и Дайер⁷
   1. Удаление культуры (или кондиционером) СМИ от 10 см ткани культуры блюдо и полоскать дважды с 6 мл ледяной PBS.
   2. Добавьте 1 mL ледяной PBS в 10 см ткани культуры блюдо, P1000 пипеткой. Урожай клетки с ячейки скребками и собирать в 2.0 мл силицированного пластиковые трубы.
   3. После центрифугирования (1000 × g, 5 мин, 4 ° C) удалите супернатант P1000 пипетки.
   4. Добавьте 1 мл метанола. Вихревой трубы кратко и sonicate на 200 Вт для 5 минут в баня типа sonicator.
      Примечание: Отрегулируйте уровень воды в ванной тип sonicator так, что клетки гранулы эффективно гомогенизации.
   5. Перевести огневки клеток в метаноле, пипетки в пробирки (13 мм x 100 мм) с тефлоновым покрытием колпачки.
   6. Добавить 1 мл метанола, 1 мл хлороформа, 0,8 мл двойной дистиллированной воды и 50 мкл 10 мкмоль/Л внутреннего стандарта d18:1 /(D₃₁)-16:0 см в каждую пробирку.
   7. Вихревой пробирки энергично за 5 мин при комнатной температуре.
      Примечание: В этот момент одна фаза (хлороформ/метанол/вода = 1/2/0,8 (v/v/v)) формируется.
   8. Добавьте 1 мл хлороформа и 1,0 мл двойной дистиллированной воды.
   9. Вихревой трубы энергично при 2500 об/мин за 5 мин при комнатной температуре.
      Примечание: на данный момент, водный (верхний) фаза и фаза органических (Нижняя) разделены.
   10. После центрифугирования (2150 × g, 5 мин, 25 ° C), сбора и передачи нижней фазе в одноразовых стеклянных трубок (начальная фаза ниже).
       Примечание: Собирайте этапа ниже, с помощью пипетки Пастера и пипетки фильтр безопасности. Вставьте наконечник пипетки в нижней фазе, сожмите небольшие лампочки рядом с «E» клапан доставить Верхний этап и межфазного пух внутри кончиком пипетки и затем сифон нижней фазе в пипетку.
   11. Добавьте 2 мл хлороформа в пробирки и вихревых трубок энергично при 2500 об/мин за 5 мин при комнатной температуре достаточно смешать с верхнего этапа и межфазного пух.
   12. После центрифугирования (2150 × g, 5 мин, 25 ° C), собирать и передавать изменение нижней фазе в одноразовых стеклянных трубок с этапа первоначального ниже, как описано в шаге 1.1.10.
   13. Разместите стеклянных трубочек под поток азота и полностью удалить органических растворителей в собранных нижней фазе.
   14. Восстановить образцы с 500 мкл метанола или этанола, фильтрата с 0,02 мкм фильтром и хранить в стеклянных флаконах в-20 ° C.
2. Пробоподготовка для построения калибровочной кривой и проверка метода
   1. Добавьте 50 мкл 0.1, 0.5, 1, 5, 10 или 50 мкмоль/Л стандартного комплекса (d18:1 /(D₉)-18:1 см) в пробирки с тефлоновым покрытием колпачки.
   2. Добавление ячейки огневки в каждую пробирку и добавить метанола в 1 мл.
      Примечание: Количество клеток огневки как матрица варьируется в зависимости от каждого эксперимента. Если регулярно анализируются SM видов в образцах, полученных от клеток в культуре 10 см блюдо, количество клеток огневки в каждую пробирку должно быть близка к клеток в культуре 10 см блюдо.
   3. Экстракт всего липидная фракция, как описано в шагах 1.1.6-1.1.14.
   4. Подготовьте проверки качества (КК) образцов для проверки метода как различал в 1.2.1-1.2.3 шаги. Подготовить три КК образцы с различной концентрации стандартного комплекса (d18:1 /(D₉)-18:1 см): один в течение 3 x нижнюю границу калибровочной кривой (QC-низкий, QC-L), один недалеко от центра (QC-среднего, QC-M) и один вблизи верхней границы калибровочной кривой (QC-высокий, QC-H).

2. SM анализ LC-ESI-MS/MS

1. Подготовка этапа мобильных
   1. Смесь растворителей (ацетонитрил/метанол/ddH₂O = 2/2/1 (v/v/v) для водной фазе и изопропиловый спирт для органической фазы) в стеклянные бутылки с тефлоновым покрытием колпачки и sonicate за 5 мин в баня типа sonicator.
   2. Добавить муравьиной кислоты (конечная концентрация 26,4 ммоль/Л) и NH₄OH (14,9 ммоль/Л) в каждой мобильной фазу.
2. Качественный анализ SM LC-ЭСИ-МС³
   1. Активировать систему высокопроизводительной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), поставил впускной трубы в стеклянные бутылки, которые содержат подвижных фазах и очистить линии ВЭЖХ. Связать столбец HPLC C₁₈ (длина 100 мм × 1,5 мм и.д., частиц размер 3,0 мкм) ВЭЖХ системы, поддержания температуры в духовке столбца при 50 ° C и состояние столбца с водной фазе мобильных минимум 100 мкл/поместить образцы в стойку образца в autosampl э.
   2. Установите параметры тройной квадрупольного и квадрупольного линейной ионной ловушки масс-спектрометрии системы для анализа³ МС, перечисленных в таблице 1 и таблице 2 , а также первый и второй прекурсоров ионов SM видов, представляющих интерес.
      1. Дважды щелкните значок программного обеспечения для сбора данных, дважды щелкните конфигурацию оборудования, выберите «LC + QTRAP4500 + клапан» и нажмите кнопку «Активировать профиль».
      2. Создайте новую вложенную папку, нажав кнопку «Новый подпункт проекта» и «OK».
      3. Нажмите на вкладку «файл», выберите «New» и выберите «Приобретение метод» и «OK». Щелкните значок «Масса Spec» и «MS» tab. Выберите проверять тип как «MS/MS/MS (MS3)», скорость сканирования как 10000 Da/s, полярности как «Отрицательных» и «Длительность» как все время быть проанализированы (мин). Значение m/z «Start (Da)» и «Stop (Da)» как диапазон проверяемых. Значение m/z 1-го и 2-й прекурсоров ионов целевых видов SM интерес.
         Примечание: Для анализа нескольких видов SM, выделите '-MS3' значок, щелкните правой кнопкой мыши, выберите «Копировать этот эксперимент», а затем положить m/z ионов прекурсора 1 и 2 других видов SM.
      4. Выберите вкладку «Advanced MS» и значение каждого параметра следующим образом: режим сканирования как «Профиль», размер шага как 0.12 (Da), резолюции Q1 и Q3 «Блок» и «ОСВЕЩЕННЫЕ», соответственно, интенсивность порог как 0, параметр времени 50 (МС), паузы между массовые диапазоны как 1,5 мс, выберите ' динамический заполнить время ', Q3 барьеры как 8 V и возбуждения время как 25 мс.
      5. Нажмите кнопку «Изменить параметры» на вкладке «MS» и выберите «источник/газ» tab. Установите параметры занавес газа, газа столкновения, ionspray напряжения, температуры, ионный источник gas1 и gas2, перечисленных в таблице 1. Затем выберите вкладку «Соединения» задать параметры declustering потенциал, потенциал вход, столкновения энергии, энергии возбуждения и энергии столкновения распространились как перечисленные в таблице 2.
      6. Выделите «Интегрированный Valco клапан» и выберите «позиции имя для шага 0' а и установите «B» как позицию для всего времени 5.0 мин. Также установить «A» в качестве позиции для всего времени 70.0 мин.
      7. Выделите «Симадзу LC системы». Выберите вкладку «Насос» и установите режим перекачки как двоичный поток, общий поток 0.28 мл/мин, а максимум пределы давления как 20,0 МПа. Выберите вкладку «Автоматический пробоотборник» и установить объем промывки как 200 мкл, игла инсульта как 52 мм, ополаскиватели скорость как 35 мкл/s, выборки скорость как 5.0 мкл/s, очистить время как 25,0 мин, промойте время падения 5 s, а режим полоскания как «До и после аспирации».
         1. Кроме того, включить блок охладителя, установить кулер температура 4 ° c и ход иглы флакон управления как 52 мм. Выберите вкладку «Печи» включить духовку и установите температуру духовки и максимальная температура 50 ° C до 85 ° C, соответственно.
         2. Выберите вкладку «Контроллер» и установите флажок «Власть на». Выберите вкладку «Время программа» и установите растворителя градиенты следующим: Растворители A / B в соотношении 100/0 для 5мин, программа линейного изменения 80/20 более 4 минут, до 35/65 свыше 50 мин и 25/75 более 1 мин после , держать их в 25/75 за 10 мин, затем линейно до 100/0 свыше 4 мин. Затем сохраните этот метод.
   3. Создайте пакетный файл
      1. Дважды щелкните значок «Построить приобретения пакета», нажмите кнопку «Добавить набор», «Добавить образцы», количество новых образцов и нажмите кнопку «OK».
      2. Нажмите кнопку «Редактор метода ' и выберите метод для использования. Если в одном пакетном файле используется несколько методов, установите флажок «Использовать несколько методов» и выберите метод приобретения для каждого образца. Переименование «Имя образца», установите соответствующий номер для «Флакон позиции» и поставить количество объем впрыска. Затем сохраните пакетный файл.
   4. Приобрести продукт³ MS Ион спектры SM видов интерес LC-ЭСИ-МС³ анализа
      1. Выберите вкладку «Отправить» в пакетный файл, выделите строку образцов для анализа и нажмите кнопку «Отправить».
      2. Нажмите кнопку '' зрения Quene', «Equilibrate» значок, выберите метод приобретения, чтобы использоваться, установите время как 1 мин и нажмите кнопку «OK».
      3. Деактивируйте «Резервный инструмент для настройки», нажав на соответствующий значок. Затем выполните пакетную операцию, щелкнув значок «Запуск образца».
   5. Назначить каждой MS³ продукта Ион спектры SM, сравнивая массы заряда коэффициент (m/z) продукта Ион спектры и точные массы сфингоидные LCB и N-ацил остаток интерес. Определить число атомов углерода и двойной облигаций в сфингоидные LCB и N-ацил остаток по данным соответствующего продукта ионов.
      1. Убедитесь, что выбрана папка надлежащих подпроектов, затем дважды щелкните значок «Открыть файл данных» и выберите образцы для анализа. Перетащите пик в Хроматограмма для каждого целевого SM видов, а затем дважды щелкните. Будут представлены полученные³ MS продукт Ион спектров в данную область.
3. Количественный анализ SM, LC-ESI-MS/MS
   1. Установите подвижных фазах и ВЭЖХ столбец, как описано в шаге 2.1 и 2.2.1.
   2. Задайте параметры тройной квадрупольного и линейной ионной ловушки квадрупольного масс-спектрометрии системы для нескольких реакции, мониторинг (MRM) анализ, перечисленных в таблице 1 и таблице 2.
      1. Проводить процедуры, как описано в шаге 2.2.2.1 и 2.2.2.2.
      2. Нажмите на вкладку «файл», выберите «New» и выберите «Приобретение метод» и «OK». Нажмите значок «Масса Spec» и «MS» tab. Выберите проверять тип как «МРМ», полярность как «Положительных». Установите «Продолжительность» как все время для анализа. Установите m/z [M + H]⁺ и 184 как «Q1 массы (Da)» и «Q3 массы (Da)» целевых видов SM интереса, соответственно. Установите «Время» 10 мс и «ID» как имя целевого SM видов.
      3. Выберите вкладку «Advanced MS» и значение каждого параметра следующим образом: обе резолюции Q1 и Q3 как «Блок», интенсивность порог 0, установив время как 0 (МС) и паузы между массовые диапазоны как 5 мс.
      4. Нажмите кнопку «Изменить параметры» на вкладке «MS» и выберите вкладку «Источник/газ» параметр занавес газа, газа столкновения, ionspray напряжения, температуры, ионный источник gas1 и gas2, перечисленных в таблице 1. Затем выберите вкладку «Соединения» положить параметры declustering потенциал, потенциал вход, энергию столкновения и столкновения клеток выхода потенциал, перечисленные в таблице 2.
      5. Установите клапан, как описано в шаге 2.2.2.6.
      6. Задайте условие LC, как описано в шаге 2.2.2.7. Затем сохраните этот метод.
   3. Создайте пакетный файл, как описано в шаге 2.2.3.
   4. Получите данные Записями каждого вида SM LC-ЭСИ-MS/MS анализа как описано в шаге 2.2.4.
   5. Процесс управления записями сообщений данных с использованием программного обеспечения для интеграции данных и получать данные о площади пика для извлечения ионов Хроматограмма каждого вида см.
      1. Дважды щелкните значок программного обеспечения для интеграции данных в количественный анализ, нажмите на вкладку «Edit» и выберите пользователя интеграции по умолчанию. Задать ширину Гаусса гладкой как 1.0 точки и нажмите кнопку «OK». Нажмите на вкладку «Edit» и выберите «Новая таблица результатов». Выберите образец, чтобы быть интегрированы, нажмите кнопку со стрелкой и нажмите кнопку «Далее». Выберите «Создать новый метод», задайте имя метода и нажмите кнопку «Далее». Нажмите кнопку «Далее» и установите флажок d18:1 /(D₃₁)-16:0 SM как есть, нажмите «Далее» и нажмите «Готово».
      2. Нажмите кнопку «Отображает обзор пик» и подтвердите, что вершины Хроматограмма надлежащим образом признаются. Следует отметить, что время удерживания d18:1 /(D₃₁)-16:0 SM обычно меньше по ~ 0,3 мин по сравнению с 34-1 см (обычно состоит из d18:1 / 16:0 SM).
   6. Количественно каждый SM видов согласно отношение пик каждый SM видов d18:1 /(D₃₁)-16:0 SM внутренний стандарт.
      1. Перейдите на вкладку «Файл», выберите «Экспорт», выберите «Таблица результатов», подтвердить формат как «MultiQuant», столбцы как «Экспорт всех столбцов», строки «Экспортировать все строки, за исключением тех явно скрытые», а затем нажмите кнопку «OK».
      2. Откройте экспортированный файл в программе Excel. Нормализовать области целевых видов SM в области ИС (d18:1 /(D₃₁)-16:0 SM). Затем умножьте на теоретическое количество IS в образце вводят для расчета суммы целевых видов SM в закачиваемой образец.
4. Построение калибровочной кривой
   1. Получить данные Записями d18:1 /(D₉)-18:1-SM и d18:1-/(D₃₁)-16:0 SM в образцах для построения калибровочной кривой LC-ЭСИ-MS/MS анализом, как описано в шаге 2.3.1-2.3.4.
   2. Получение данных о площади пика d18:1 /(D₉)-18:1-SM и d18:1-/(D₃₁)-16:0 SM, как описано в шаге 2.3.5.
   3. Рассчитать количество d18:1 /(D₉)-18:1 см в закачиваемой образец как описано в шаге 2.3.6.
   4. Построить линию тренда, установив оси x и y как номинальная сумма и вычисленное количество d18:1 /(D₉)-18:1 см и получить Формула тренда.
5. Проверка количественный метод, с помощью Microsoft Excel программного обеспечения
   1. Для проверки метода, подсчитать количество d18:1 /(D₉)-18:1-SM и d18:1-/(D₃₁)-16:0 SM в КК образцы, анализируя каждый КК образца по крайней мере три раза в течение 1 дня и повторять по крайней мере 3 дней, как описано в шаге 2.3.1-2.3.4.
   2. Получение данных области пик и рассчитать количество d18:1 /(D₉)-18:1 см в закачиваемой образец как описано в шаге 2.3.5 и 2.3.6.
   3. Согласно полученной калибровочной кривой, рассчитать количество d18:1 /(D₉)-18:1 см в закачиваемой образец.
   4. Оценка точности
      1. Вычислить среднее и стандартное отклонение количества d18:1 /(D₉)-18:1 SM, полученные на шаге 2.5.3 на наборе intra-day и торгующим через день с помощью Excel программного обеспечения.
      2. Средний показатель, полученный на шаге 2.5.4.1 делится, стандартное отклонение и выражается в %.
   5. Оценка точности
      1. Рассчитайте точность каждого из данных следующим образом:
         [(Подсчитанная сумма полученного на шаге 2.5.3.) / (Номинальная сумма) - 1] × 100(%)
      2. Вычислить среднее абсолютное значение точности набора данных внутри-и межучрежденческой дня.

Химически синтезированных d18:1 / см (рис. 1A) и d18:1 24:0 / 24:0 SM в образцах липидов, извлеченные из клеток HeLa (рис. 1Б) были проанализированы LC-ЭСИ-МС³ использованием [M + HCOO]^– и [M-CH₃]^- как первый и второй прекурсоров ионы, соответственно. Обратите внимание, что интенсивность спектра деметилированное sphingosylphosphorylcholine (СПК) (m/z 449) больше, чем у SM N-ацил остаток (m/z 378). Кроме того, спектр, соответствующие [M-холин CH₃ (сфингозин-1-фосфата)]^– также полезно назначить LCB SM. Мы также подтвердили, что спектр деметилированное SPC (m/z 449) в основном производится из d18:1 НПЦ в условиях нашего анализа³ мс (рис. 1C).

Калибровочной кривой с помощью двух гетерогенны помечены SM видов было показано в рисунке 2A. Линии тренда была получена путем применения 1 / x², в качестве коэффициента взвешивания. Результат анализа остаточного был показан на рисунке 2B. Обратите внимание, что остаточная стоимость недалеко от нижнего предела количественный (0.1 пмоль в этом настоящем исследовании) был меньше, применив 1 / x², в качестве коэффициента взвешивания.

Параметры полученных калибровочной кривой и результат проверки были показаны в таблице 3. Значение точности и точности были в пределах ± 15%, показаны, что настоящее исследование удовлетворяет критериям как количественный метод с использованием LC-MS⁸.

Количество каждого вида SM в клетки HeLa была показана в таблице 4. НеЬа клетки были выращены в культуре средств массовой информации, содержащие 10% FBS и собранный. D18:1 / 16:0 SM и d18:1 / 24:1 SM были наиболее и вторым наиболее распространенным SM видов, структура которого были определены и состоят из 54% и 14% всего см, соответственно

Рисунок 1 . MS³ спектры сигналов конкретных m/z см в клетки HeLa. MS³ спектры химически синтезированных d18:1 / 24:0 SM (A) и d18:1 / 24:0 SM в образцах липидов, извлеченные из НеЬа клетки (B) отображаются. Результаты были адаптированы из Хама и др. ⁶ Обратите внимание, что интенсивность спектра НПФ больше, чем N-ацил остаток спектров³ сантиметр MS химически синтезированных d18:1 НПЦ приведены в (C), используя ионов с идентичными m/z ([M + HCOO]^-, м /z 499) как прекурсор ионы 1 и 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 . Калибровочных кривых с помощью двух видов гетерогенны помечены SM SM. (A) калибровочной кривой с помощью двух гетерогенны помечены видов SM (d18:1 /(D₉)-18:1-SM и d18:1-/(D₃₁)-16:0 SM). Калибровочные кривые были построены с использованием весовой коэффициент = 1 / x². В таблице 3перечислены результаты проверки. (B) остаточный анализ для оценки добра построенному градуировочному. Остатки в калибровочной кривой с помощью весовой коэффициент = 1 / x² меньше, чем те, с использованием весовой коэффициент = 1 / x или 1, особенно в более низкое количество d18:1 /(D₉)-18:1 сантиметр , пожалуйста, нажмите здесь чтобы посмотреть большую версию этого Рисунок.

Таблицы 1. Условия для качественного и количественного анализа источника ионов электроспрей. Эта таблица была адаптирована из Хама и др. ⁶

Таблица 2. Параметры MS³ и режим управления записями сообщений в тройной квадрупольного и квадрупольного линейной ионной ловушки массового спектрометрирования используется для качественного и количественного анализа, соответственно. Эта таблица была адаптирована из Хама и др. ⁶

В таблице 3. Параметры полученных калибровочной кривой и результат проверки. Результаты были адаптированы из Хама и др. ⁶

Таблица 4 . Количество каждого вида SM в клетки HeLa. НеЬа клетки были выращены в культуре средств массовой информации, содержащие 10% FBS. Клетки были собраны, и общая липидная фракция было извлечено методом Bligh и Дайер. Результаты были адаптированы из Хама и др. ⁶

В настоящий качественный метод, мы получили MS³ продукта ионов SPC и N-ацил остаток. Важно, чтобы правильно назначить SPC и N-ацил остаток. В этой связи следует отметить, что другие молекулы, содержащие фосфорилхолин также могут быть обнаружены как MS³ продукта ионов. Diacyl фосфатидилхолин (PC) и Плазмалогены PC изобилии присутствуют в клетках млекопитающих, и их гидрофобность подобна SM. Таким образом diacyl- и Плазмалогены ПК с изотопом (обычно ¹³C) может быть теоретически обнаружен одновременно с см. В наших экспериментах MS³ продукта ионов Плазмалогены PC одновременно наблюдались в анализе SM. Это полезно для правильно выбрать MS³ продукта ионов SM, чтобы знать, что интенсивность спектра НПФ больше, чем у SM N-ацил группу (рис. 1A и B). В противоположность этому, интенсивность жирных ацил остаток больше, чем (или почти так же, как), demethylated lysoplasmalogen-PC (данные не показаны).

В нынешний количественный метод важно точно подготовить образцы для построения калибровочной кривой и проверка метода. Кроме того весовой коэффициент должен быть должным образом используется для построения калибровочной кривой; Это полезно для улучшения кривой, особенно при низкой концентрации. Мы сравнили калибровочных кривых, используя различные весовые коэффициенты. Кривой на низкой концентрации явно была улучшена с помощью весовой коэффициент = 1 / x² по сравнению с, что использование весовой коэффициент = 1 или 1 / x (рис. 2B). Значение точности и точности должна быть в пределах ± 15%. Если концентрация QC-L идентичен нижнюю границу калибровочной кривой (нижний предел количественный), она должна быть в пределах ± 20%⁸.

Мы использовали метод Bligh и Дайер для извлечения всего липидная фракция из культивируемых клеток в данном исследовании. Другие методы для извлечения липидов, например метод Folch также являются полезным⁹. Важно, чтобы извлечь липидная фракция, используя соответствующий метод согласно сумме или свойства образцов. Число видов SM, одновременно анализируется в каждой инъекции не должно быть слишком большим для того, чтобы предотвратить перегрузку программное обеспечение для сбора данных. Запланированное МНО будет полезным для quantitating ряд видов SM одновременно.

Наш нынешний метод, с помощью MS³ анализа полезно размышлять, количество углерода и двойные скрепления LCB и N-ацил общие см без дополнительных устройств. Однако нельзя получить другие структурную информацию, как расположение двойных связей, изомер (СНГ или транс) и форму (прямой или разветвленные). Это необходимо для получения продукта ионов и их структурная информация, с помощью дополнительных инструментов^10,11,12,13использовать более высокой энергии. Молекулярная формула продукта ионов соответствует N-ацил постановление было [РРО₂]^– ионов, которые не содержат азота. В настоящее время неизвестно, как столкновение индуцированная диссоциации доходов.

Для анализа³ МС важно настроить параметры энергии столкновения (CE) и возбуждения время для MS³ фрагментации (ExT). Выше CE будет привести к избыточной фрагментации и уменьшить интенсивность продукта Ион demethylated SM как Ион 2^nd прекурсоров. Кроме того осколков зависит значительно доб. Перед эксперименты, желательно, чтобы определить соответствующее условие CE и ExT, максимизировать интенсивность продукта ионов demethylated SM, SPC и N-ацил остаток вливая синтетических SM растворяют в подвижных фазах.

Мы использовали d18:1 /(D₉)-18:1-SM и d18:1-/(D₃₁)-16:0 как два вида гетерогенны помечены SM SM для построения калибровочной кривой. Эффективность ионизации зависит от видов SM и состояние этапа мобильных. Таким образом если количество SM интерес ограничено, желательно подготовить гетерогенны помечены SM видов, представляющих интерес для более точный количественный.

Согласно Ион прекурсоров и Ион продукт, соответствующий деметилированное SPC пока определена структура SM. Кроме того он иногда мешает точно определить нижний предел количественный в матрице образца присутствие, поскольку целевых соединений, представляющих интерес были обильно представлены в матрице образца.

Настоящее исследование является полезным оценить количество углерода и двойных связей в LCB и N-ацил группу на основе их соответствующего продукта ионов в MS³ экспериментов без дополнительных инструментов. Кроме того мы представляем метод количественного анализа для SM с использованием двух стабильных гетерогенны помечены SM видов, что облегчает определение диапазона, используемые в SM количественный. Нынешний метод будет полезным при характеристике различных видов уникальных SM в различных биологических образцов и промышленных товаров.

Авторы заявляют, что они имеют никакого конфликта интересов.

Эта работа была поддержана исследовательский грант от министерства образования, культуры, спорта, науки и технологии Японии (KAKENHI) для К.Х. (#15 K 01691), Ю.Ф (#15 K 08625), к.ю. (#26461532) и Грант для изучения сложных заболеваний проекта от министерства Здравоохранения, труда и социального обеспечения (к.ю. #201510032A). Мы благодарим группу Edanz (www.edanzediting.com/ac) для редактирования проекта этой рукописи.