ДНК-полимераза деятельности пробирного с использованием флуоресцентных помечены ДНК ближней ИК-области визуализирована электрофорезом геля акриламида

Этот протокол описывает характеристики синтеза ДНК-полимеразы измененных ДНК путем наблюдения изменений в ближней ИК-области дневно обозначенные ДНК с помощью электрофореза геля и гель изображений. Акриламид Гели используются для отображения с высоким разрешением разделения коротких нуклеиновых кислот, которые мигрируют по различным ставкам в зависимости от размера.

Для любого ферментов надежные, количественные методы необходимы для характеризации как родного, так и инженерии ферментов. Для ДНК-полимеразы синтез ДНК можно охарактеризовать с помощью в vitro ДНК синтеза assay следуют электрофореза геля полиакриламида. Цель этого анализа заключается в количественном определении синтеза ДНК природных и модифицированных ДНК (M-ДНК). Эти подходы являются особенно полезными для урегулирования олигонуклеотиды с резолюцией единичных нуклеотидных, позволяя наблюдения отдельных шагов во время синтеза олигонуклеотида ферментативные. Эти методы были применены к оценке массива биофизических и биохимических свойств, таких как измерение константы скорости установившегося отдельных этапов синтеза ДНК, ошибка скорость синтеза ДНК и ДНК сродство. С помощью изменения компонентов, включая, но не ограничиваясь, модифицированных нуклеозидов трифосфаты (NTP), M-ДНК, и/или мутант полимераз, относительной полезности субстрата ДНК-полимеразы, которую можно эффективно оценивать пар. Здесь мы подробно assay, включая изменения, которые должны быть сделаны для размещения нетрадиционных грунтовка ДНК маркировки таких стратегий, как инфракрасный дневно помечены ДНК. Кроме того мы подробно важнейшие технические шаги для заливки гель акриламида и запуск, который часто может быть технически сложным.

Полимераз выполняют точные и эффективные синтез ДНК и необходимы для поддержания целостности генома. Способность синтезировать сотни нуклеотидов в секунду без внесения ошибок также делает ДНК полимеразы необходимыми инструментами в молекулярной биологии и биотехнологии. Однако эти свойства также ограничить приложения для M-ДНК субстратов; вообще говоря, природные полимераз не может синтезировать многие потенциально ценные М-ДНК субстратов, вероятно из-за высокой селективного давления против использования нестандартных субстратов в естественных условиях. Многие группы разработали направленной эволюции подходов для создания мутантных полимераз способны M-ДНК синтез^1,2,3,,45; Эти усилия расширили биотехнологических утилита ДНК^6,,78.

Для оценки способности мутантных полимераз синтезировать M-ДНК, мы^9,10и другие^11,12,13 обычно используют в vitro измерения ДНК активность полимеразы, которые описаны в этой рукописи. В этих экспериментах полимераз совместно инкубируют с меткой дуплексный шаблон грунт и нуклеозидов трифосфата субстратов; Продукция оцениваются электрофорезом геля. В зависимости от конкретных экспериментальных вопрос, мутант полимераз, изменение грунтовки может использоваться измененные шаблоны или модифицированных нуклеозидов трифосфаты, позволяя систематической оценки биохимических мутант ферментативной активности.

Исторически эти assays полагаются на 5' радиоактивных метку для отслеживания синтеза ДНК; чаще всего использовались ³²P и ³³P; как правило маркировка достигается с помощью T4 полинуклеотид киназу¹¹. Однако из-за ограниченное время жизни и относительно высокая стоимость и их безопасного захоронения радиоактивных этикетки, наша группа вместо этого использует инфракрасный Флюорофор синтетические 5' помечены ДНК. С помощью относительно недорогих ближней ИК-области гель тепловизор, мы наблюдали аналогичные пределы обнаружения в предыдущих исследованиях с использованием радиоактивных этикетки (неопубликованные результаты). Мы успешно воспроизводить прошлые замечания⁹, и мы не наблюдали большие количественную разницу с ранее измеренного коэффициента константы (неопубликованные результаты).

Чтобы проанализировать размер ДНК и таким образом, степень синтеза ДНК, мы полагаемся на методы электрофореза геля полиакриламида, первоначально разработанных для Сэнгер последовательности¹⁴ до появления капиллярного электрофореза¹⁵. Расстояние от разделения и мобильность может использоваться как измерения молекулярной массы; большой формат, вертикальные полиакриламидные гели можно добиться единичных нуклеотидных резолюции, включение количественных наблюдения ДНК-олигонуклеотиды различной длины.

В совокупности эти эксперименты являются надежный метод для характеризации полимеразы. Из-за время деликатный характер реакции, подготовка и уход необходимо добиться воспроизводимость результатов. Кроме того в то время как гель акриламида является весьма эффективным способом измерения синтез ДНК, а также многочисленные другие ДНК изменения реакции, с резолюцией единичных нуклеотидных, это может быть технически сложным. Здесь протокол позволит пользователям выполнять эти эксперименты избегая наиболее распространенных ошибок.

1. деятельности пробирного

Примечание: существует два типичных видов анализов, которые часто выполняются характеризовать полимераз, используя методы, описанные здесь. Они отличаются ли они качественно характеризуют общую синтеза (охватывающей многие шаги синтеза ДНК) или ли они количественно сосредоточить внимание на отдельных шагах. Мы описывают шаги, необходимые для каждой из них ниже.
Примечание: Поскольку Ассамблея материалов являются относительно сложными, для времени чувствительные эксперименты, мы рекомендуем заранее собраны все материалы. Рецепты всех важнейших компонентов assay, перечислены ниже. Коммерческие поставщики компонентов, перечислены в Таблице материалов.

1. 10 x рецепт буфера SF (10 x SFB)
   Примечание: В нашем анализов, мы обычно используют N-терминальный усечение из ДНК-полимераза I Thermus бактерии, широко известный как Штоффель фрагмент (SF) ^{16 , 17}. Рецепт здесь является предпочтительным буфер для SF ^{3 , 13}. Другие буферы могут быть заменены в зависимости от конкретных ДНК-полимераза.
   Примечание: Конечная концентрация 10 x буфер компоненты SF являются 500 мм трис рН 8,5, 65 мм MgCl ₂, 0.5 мг/мл BSA, 500 мм KCl (s) и ультрачистая вода. Измерения являются за 1 мл SF буфера, которая достаточна для 100-200 анализов, в зависимости от масштаба. Буфер может храниться бессрочно при-20 ° C.
   1. Комбинат 0,5 мл 1 м трис, 65 мкл MgCl 1 М ₂, 50 мкл BSA 10 мг/мл и 0.0373 г KCl (s) в 1,5 мл трубки. 385 мкл сверхчистой воды для достижения окончательный объем 1 мл.
2. 1 x буфер хранения рецепт (1 x SB)
   Примечание: конечная концентрация 1 x буфер компоненты являются 50 мм трис pH 7.5, 1 мм DTT, ЭДТА 0,6 мм и 50% глицерина. Рецепт делает 20 мл 1 x SB.
   1. Объединить 0,012 г DTT, 100 мкл ЭДТА 0,5 М и заполнить 50 мл Конические трубки с 40 мл 100 мм трис (рН 7,5), чтобы сделать 2xSB. Микс от vortexing.
   2. Передачи 10 мл 2 x SB новой 50 мл конические пробки и разбавляют глицерина, добавив 10 мл глицерина в новый конические.
3. Рецепт буфера оранжевый (QBO) охлаждение
   Примечание: при использовании радиоактивных этикетки, пользователи будут часто используют бромфеноловый синий или ксилола cyanol как отслеживания краситель для электрофореза прогресса. Однако эти красители будет слабо флуоресцировать в ближней инфракрасной области, мешая ДНК сигнала. Таким образом мы используем оранжевый G на их месте для всех реакций, которые содержат образцы. Хотя мы нашли оранжевый G подходит для отслеживания загрузки гель, мы нашли оранжевый G быть менее последовательным как краситель, который отслеживает прогресс электрофореза; Таким образом мы запускаем пустые полосы, содержащие бромфеноловый синий на внешней полосы геля, которые не содержат образец для того, чтобы отслеживать ход гель.
   1. Объединить 950 мкл 95% формамида с 25 мкл ЭДТА 0,5 М, и 25 мкл ультрачистая вода. Добавьте 1 совок оранжевый краситель G (~ 10 мг). Микс от vortexing.
      Предупреждение: Формамид токсичен; носить средства индивидуальной защиты (СИЗ) как перчатки, очки и лаборатории пальто и распоряжаться как опасные отходы.

2. Assay Run

1. качественные характеристики общей активности
   Примечание: для этого анализа, мы обычно поддерживать постоянной концентрации M-противотуберкулезные и меняются. Цель – оценить общие характеристики белка вместо того, чтобы измерить любого отдельного шага. Подготовить одну реакцию, равный объем двух отдельных компонентов, дуплекс смеси (описано в шаге 2.1.1) и dNTP смеси (описано в шаге 2.1.2), будет подготовлен отдельно и затем объединяются, чтобы дать окончательный объем 49 мкл. Добавление 1 мкл 50 x фермента будет затем инициировать реакцию. Переменная время точки могут быть приняты; как правило мы утолить в 0, 5, 15 и 60 мин.
   1. Подготовки ДНК дуплекс микс
      Примечание: дуплекс смесь состоит из 10 x буфер SF, праймера олигонуклеотида, шаблон олигонуклеотида и ультрачистая вода. Общий объем, добавил к каждой реакции составляет 25 мкл. 1 мкл фермента будут добавлены к главной смеси непосредственно до начала эксперимента.
      Примечание: Для наших тестов, мы обычно используется шаблон 45-mer и 18-mer или 23-mer грунтовка. В то время как можно использовать ряд различных длин, мы склонны использовать эту длину, потому что продукция (начиная от 18 нуклеотидов до 45 нуклеотидов) легко разрешаются на уровне одного нуклеотида используя протоколы электрофореза геля описанных. Олигонуклеотида продукты с увеличением длины, он может быть сложным решить продукции на единичных нуклеотидных резолюции.
      Примечание: В наших экспериментах, мы используем 5 ' ближней ИК-области Люминесцентную краску этикетку на стренги грунтовка соблюдать грунтовка продукции. Мы покупаем пользовательских синтезированные олигонуклеотиды, с учетом этой модификации; Однако эта метка могут быть включены с помощью любое количество пост синтетических маркировки стратегий. Шаблон олигонуклеотида не обозначена, и поэтому не наблюдается с помощью томографа гель. Для обоих олигонуклеотиды, мы храним олигонуклеотиды на 100 мкм в 10 мм трис (рН 8), 1 мм ЭДТА.
      Примечание: Потому, что мы наблюдаем только грунт, двукратное превышение шаблона используется для обеспечения что все грунты (ДНК видов, которые в настоящее время наблюдается) являются отжигом в шаблон. Конечная концентрация дуплекс в этой реакции является 40 Нм.
      Примечание: Ближней ИК-области флуоресцентными красителями чувствительны часто несколько легких; когда это возможно, мы покрываем грунтовка (и любое решение, содержащее праймера) с фольгой. Это включает в себя гель полиакриламида, пока она выполняется.
      Примечание: Ниже приводится представителя пример синтеза 2 ' F M-ДНК.
      1. Размыть грунт 1 и шаблон 1 (см. Таблицу материалы для последовательности) до 1 мкм в ультрачистая вода.
      2. Для каждого пробирного реакции, в отдельных труб, объединить 5 мкл 10 x буфер SF, 2 мкл 1 мкм праймера 1, 4 мкл 1 мкм шаблон 1 и 13 мкл ультрачистая вода в трубках совместим с тепловой cycler.
      3. Отжиг дуплекс в Термоциклер, используя следующую программу: 98 ° C в течение 2 мин., 70 ° C за 5 мин., 50 ° C за 5 мин, 40 ° C за 5 мин, удерживайте при 25 ° C. Конкретные программы может меняться в зависимости от отжига температура дуплексного шаблона грунтовка. Как правило, мы предпочитаем, чтобы включить по крайней мере один шаг 5 мин при отжиге температуре, а затем еще один шаг 5-мин при температуре 5-10 градусов ниже температуры отжига.
   2. Приготовления 2 x dNTP смеси
      Примечание: в зависимости от эксперимента, можно использовать переменную дНТФ и концентрации дНТФ. Как правило мы используем 50-200 мкм в реакции.
      1. Подготовка 25 мкл раствора, содержащего 100 мкм каждого 2 ' F-NTP. Магазин М-туберкулезом на 100 мм.
   3. Подготовка 50 x разведение белок
      Примечание: для длительного хранения, ферменты должны храниться при температуре-20 ° C в 1xSB. При удалении из морозильной камеры-20 ° C, ферментов должны храниться на льду во все времена перед добавлением в смесь мастер. Фермент разведений следует свежий из концентрированной запасов каждый день. Концентрированные ферментные акций должны быть возвращены в морозильник-20 ° C сразу же после использования.
      Примечание: Поскольку мы главным образом оценить мутант полимераз, мы используем только ферменты, которые были высказаны и очищается в нашей лаборатории, с использованием установленных методов ^{9 , 10}. Для коммерчески приобретенных полимеразы, пользователи должны быть осторожны оптимального буферов для различных белков и их совместимости с буферами, описываемые.
      Примечание: Концентрации фермента будет отличаться для каждого эксперимента. Здесь, мы покажем репрезентативного примера для 2 ' F-ДНК-синтез.
      1. Сделать раствором фермента 10 Нм, разбавьте 1 мкл фермента int1 x SB o сделать 50 x последний фермент концентрации. Концентрация раствора 50 x должно быть 500 Нм. Например, если концентрация запасов фермента 50 мкм, добавить 1 мкл запасов фермента 99 мкл 1 x SB.
         Примечание: Поскольку фермента обычно хранится в 50% глицерина, решение довольно вязкой. Даже если с помощью высокоточных пипетки, мы не рекомендуем закупорить менее 0,5 мкл, учитывая важность и точности во время разрежения фермента.
   4. Начало Пробирная
      1. установить температуру сухой ванны до 50 ° C.
      2. Добавить 24 мкл отожженная дуплекс смесь (см. шаг 2.1.1) до 25 мкл 2 x dNTPs (см. шаг 2.1.2).
      3. Удалить 9,8 мкл смеси в шаг 2.1.4.2 и добавить 20 мкл QBO (см. раздел 1.3 для рецепта). Этот Алиготе служит " нет фермента " управления и должно быть получено для каждого прогона.
      0,8 мкл
      4. 50 x фермента (см. шаг 2.1.3.1) в смеси дуплекс/dNTP. Пипетка вверх и вниз с большой объем микропипеткой тщательно смешать.
      5. После 5, 15 и 60 мин, утолить реакции, удалив 10 мкл каждого решения реакции и добавив к microcentrifuge трубка, содержащая 20 мкл QBO (описано в разделе 1.3).
      6. После закалку, реакции может храниться под фольгу на неопределенный срок на 4 ° C или -20 ° с.
         Примечание: Для количественной характеристики отдельных этапов синтеза M-ДНК, очень похожие пробирного можно запустить количественно получить Михаэлиса-Menten параметров. Этот assay использует все из тех же материалов. Михаэлиса-Menten параметры могут быть измерены для dNTP; в этом случае наиболее существенным различием является то, что, вместо добавления дуплекс смесь смесь dNTP, он добавляет дуплекс микс с энзимом серию 2 x dNTP решений. Аналогичным образом Михаэлиса-Menten параметры могут быть измерены для ДНК дуплекс. Чтобы удовлетворить допущения, необходимые для использования уравнение Михаэлиса-Menten должны быть выполнены конкретные условия. Эти условия и основная механика assay, хорошо объяснено в предыдущей статье методы ¹¹.

3. Электрофорез геля

Примечание: потому что лить гель время чувствительной, все материалы собраны заранее. Рецепты всех важнейших компонентов assay перечислены ниже; поставщики, перечислены в Таблице материалов.

1. Готовится акриламида 20% гель акриламида.
   Примечание: Этот рецепт делает 1 Л смеси акриламида; примерно 120 мл этого раствора используется в гель. Хранить это решение при комнатной температуре под фольгу на срок до одного года.
   Предупреждение: Полиакриламида нейротоксическое. Важно носить перчатки и лаборатории пальто на всех этапах заливки геля. Если полиакриламида получает на перчатки, немедленно замените перчатки. Если акриламида не полимеризуется, место загрязненных материалов в мешок отходов помечены полиакриламида.
   Примечание: Готовые 40% акриламида, содержащие 38,67% акриламида и 1,33% бис акриламида на мономера крест-компоновщик соотношение 29: 1 был использован в этом протоколе.
   1. Весят 17 g порошка готовые КЭ. Весят шесть отдельных частей 70 г мочевины (всего 420г).
      Примечание: Мочевина должны быть добавлены в части. Мы находим его лучше разбить его на шесть частей.
   2. Установите вверх пластиковый стакан 2 Л на табличке, перемешать. Добавьте один большой перемешивания стержня в стакан. Обложка стакан с фольгой, когда смешение для предотвращения разбрызгивания.
   3. Добавить 500 мл 40% раствора акриламида в стакан. Убедитесь, что решение является активизация.
   4. Добавить ранее весил отъезда КЭ. Добавьте один Алиготе мочевины. Разрешить решение для смешивания. Мочевина растворяется медленно и могут появиться туманно и белого при первоначальном добавлении. Медленно добавьте остальные аликвоты мочевины в смесь в течение следующего часа. Пусть смесь до тех пор, пока это совершенно ясно и бесцветный раствор.
      Примечание: Как правило, позволяют это размешать на ночь. Если решение еще не расторгнут, добавить небольшой аликвоты воды и ждать мочевины распустить.
   5. Добавление мочевины увеличит объем близко к 1 л добавьте воду для увеличения громкости на точно 1 л
   6. Магазин в тонированные стеклянные бутылки 1 Л или крышка стеклянная бутылка с алюминиевой фольгой.
2. Наливание гель акриламида.
   Примечание: При обработке стекла, будьте осторожны избежать контакта между пластинами стекла и любой твердой поверхности. Это особенно важно в том, что Неосторожное обращение может привести к небольшие трещины в стекле; Эти отказы не могут быть видны до тех пор, пока гель работает, которое происходит при более высокой температуре. Мы используем Корк кольца для предотвращения нежелательного контакта.
   1. Чистых тарелок
      1. приобрести два 33 x 42 см геля пластины, один зубчатый и одной пластиной стержня. Поместите пластины на отдельных Корк кольца.
      2. Пластины промойте водой с мылом и водой. Убедитесь, что есть нет мыла полосы или пятна геля, оставили позади.
      3. Запишите какой стороне пластины бисера меньше воды. Эта сторона является гель, с которыми сталкиваются стороны.
         Примечание: Если гель выполняется на другой стороне пластины, он может сделать гель передачи сложной.
   2. Сухой плиты
      1. использовать бумажные полотенца для просушки оба лица каждой пластины.
      2. Использование деликатную задачу дворники для просушки оставшиеся районы. Обратите особое внимание на края плит, где будет применен ленточный.
      3. Промыть стеклянные пластины с ~ 70% этиловом спирте и протрите задачи дворники.
      4. Убедитесь, что есть нет бумаги полотенце волокна или капельки воды. Это может привести к пузырей при заливке гель.
   3. Добавить прокладки
      1. приобрести прокладки 0,75 мм. Запустите перчатках пальцы под DI воды и осторожно мокрой распорки с пальцев перчатке.
      2. Место прокладки вдоль длинные края зубчатая пластина. Очистите воду, плеснул на остальной части пластины. Убедитесь, что прокладки приведены в соответствие с стеклянной пластиной и не свешивался с края.
   4. Уплотнение гель
      1. положить на сухие перчатки. Сухие края стекла снова с деликатной задачей дворники.
      2. Выравнивание стержня плита топ выше зубчатая пластина и медленно внизу нажмите пластин друг против друга. Проверьте еще раз, чтобы быть уверенным, что края всех плит выровнены.
      3. Использование геля ленты, наложите ленту во всех краев, за исключением верхней части. Убедитесь, что лента является соответствие равномерно и опечатаны плотно. Ленты могут быть применены в одно движение, или каждая сторона может осуществляться индивидуально. Вырезать концы ленты с бритвой.
      4. Добавить дополнительный слой ленты в нижнюю часть геля. Ужесточение ленты, тем меньше вероятность гель будет течь, наливая.
      5. Клип стороны стекла сэндвич с белым зажимы. Добавить 3 клипы для каждой стороны и 4 клипы в нижней.
   5. Заливки геля
      1. сделать 3 мл раствора 10% Аммония пероксодисульфат (APS), 0,3 г Аммония пероксодисульфат растворения и разбавления до 3 мл в ультрачистая вода.
         Примечание: 1,2 мл APS требуется геля. Дата трубку после его внесения. APS решения срок действия в 2 недель и должен храниться в 4 ° C.
      2. Передачи 125 мкл tetramethylethylenediamine (TEMED) в трубку отдельный microcentrifuge.
         Примечание: TEMED токсичен; носить СИЗ например, перчатки, очки и лаборатории пальто всякий раз, когда обработка.
      3. Приобрести шприц бутылку и удалить остроконечные воронку. Отмерьте 125 мл воды в мерный цилиндр и добавить к бутылке. Марк уровень воды на внешней стороне бутылки с постоянным маркером. Слейте воду. Это изменение шприц бутылки могут использоваться на неопределенный срок с надлежащей очистки (см. ниже).
      4. Настройка закупоренных кольца рядом с раковиной, так что есть место для размещения гель после того, как он вылил. Здесь место плиты сэндвич. Положите пробки в раковину, так что есть место, чтобы сидеть на пластины, в то время как гель заливается. Гель будет вылил в стеклянной пластины сэндвич в угол, поэтому нижней ляжет на пробки, а верхней ляжет на краю раковины. Убедитесь, что есть колодки под эти районы в случае полиакриламида наливает выкл
      Решение
      5. место APS и TEMED решение на другой стороне приемника, с пустой шприц бутылку. Место хорошо гребень с желаемое количество скважин на стороне приемника с пластинами. Положите 4 зажимы поблизости.
         Примечание: Следующий шаг в процедуре является очень время чувствительной. Будьте готовы быстро перемещаться через эти шаги. Существует ограниченное количество времени, чтобы получить смесь между пластинами, прежде чем его polymerizes. Все компоненты (micropipettes, пресет правильный объем, решения, стеклянные пластины) тщательно организованы налить гель как можно быстрее. Если требуется замедление полимеризации, APS и TEMED концентрации может быть вдвое; Однако, это потребует больше времени полимеризации.
      6. Залейте раствор акриламида 20% гель в шприц бутылку к помеченной точке. Налейте немного больше решения гелем выше отмеченные линии, так что достаточно решения в случае небольших утечек. Это примерно 120 мл раствора гель.
      7. Добавить 120 мкл TEMED и 600 мкл APS в геле полиакриламида раствор в шприц бутылку в то же время. Быстро добавить дополнительные 600 мкл APS решение геля полиакриламида.
      8. Быстро крышка шприц бутылку и водоворот. Поместите пластины сэндвич в раковине.
      9. Начинают лить. Это должно осуществляться только 1-2 мин, чтобы избежать полимеризации. Медленно, но неуклонно добавьте давление в шприц бутылку, поэтому решения гелем выходит равномерно. Если раствор начинает разбрызгивание нерегулярно из шприц бутылки, освободить давление, чтобы бутылка становится завышенным и возобновить лить. Часы, чтобы убедиться, что решения гелем во всех областях, и не она протекает от любой из сторон. Чтобы удалить пузырьки воздуха, измените угол пластины. Пузыри появится в верхней части и будет работать быстрее, если угол круче. По-прежнему наливание до тех пор, пока решение достиг в верхней части области зубчатый и слегка переполнена зубчатый край. Удалить все пузырьки воздуха.
         Примечание: Если плиты сэндвич утечек, или не существует достаточно решения гелем и решение не достигнет верхней части плиты, гель не может быть использован. Подождите, пока полимеризуется гель и соответственно чистый.
      10. Добавить хорошо гребенку в тарелку сандвич. Место 4 зажимы на гребень нажмите вниз и обеспечить равномерное распределение скважин.
      11. Быстро выбрасывайте оставшийся гель раствор в шприц бутылку в обозначенные полиакриламида отходы. Промойте вне шприц бутылку с ди воды 2 - 3 раза, через сопло шприц.
          Примечание: Важно для выполнения этой чистки быстро для предотвращения засорения в шприц бутылку полиакриламида. Если даже небольшое количество полимеризации происходит в сопло, следующий гель будет заливаться слишком медленно и не успешно. Отменить шприц бутылку, если происходит полимеризация.
3. Под управлением гель акриламида
   1. хотя это время полимеризуется гель, сделать 1 x TBE идущий буфер. 17 g готовые КЭ твердых Растворите в 1 Л сверхчистой воды. Встряхните буфера до тех пор, пока все КЭ растворяется.
   2. Удалить все зажимы из плиты сэндвич.
   3. Использовать бритву разрезал ленту и удалите ленту из всех краев плиты сэндвич.
   4. Чистого покинуть все полимеризованные гель из стеклянных поверхностей. Используйте бритву по краям соскрести остатки геля. Протрите тарелки бумажные полотенца и водой для удаления остатков столько полиакриламида как можно скорее. Избыток акриламида и/или ленты часто можно записать во время электрофорез геля.
   5. Удалить хорошо гребенку, вставив его равномерно на обе стороны.
   6. Использовать бритву срезать избыток геля в верхней части плиты сэндвич. Срез вдоль зубчатой кромки плиты.
   7. Использовать шприц и DI воды Промыть лунки и удаления мусора в скважинах. Убедитесь, что каждый может быть заполнен водой и не заблокирован, избыток полимеризованной геля.
   8. Место плиты сэндвич в аппарат, так что больше пластина наружу, и зубчатый пространство лицом внутрь.
   9. Клипы добавить клип плиты сэндвич и алюминиевые пластины вместе с аппаратом. Добавить к снаружи пластины для содействия даже запуск.
   10. Добавить КЭ буфер для покрытия базовых вырезами и просто достаточно, чтобы покрыть скважин на вершине. Буфере TBE могут быть отфильтрованы и повторно для приблизительно 5 гели.
   11. Теплый пластины для 20 мин, запустив электрофорез геля на 50 Вт.
   12. После потепления пластины, очистить скважин. Используйте шприц и буфере TBE в ваннах в шприц оставшиеся буфера солей из скважин. Сделайте это несколько раз, чтобы обеспечить чистой скважины. Если скважины не являются чистыми, полос будет увядать и изображение не будет интерпретировать данные. Хотя это может занять много времени, мы сочли необходимым для получения качественных данных.
   13. К внешней полосе с обеих сторон, накапайте 5 мкл 95% формамида бромфеноловый синий. Это же решение как QBO, но с бромфеноловый синий вместо G. оранжевый Это обеспечит запуск визуального на где резать гель для изображений и как далеко вниз ДНК.
   14. Для каждой выборки для анализа (созданного в разделе 2.1.1), 3 мкл в одну скважину геля. После загрузки все образцы, подождите 1 мин для образцов селиться.
   15. Поставить колпаки на верхней и нижней пластиковые ванны. Подключите провода к аппарату. Красный цвет указывает положительный электрический заряд, поэтому она должна быть внизу, таким образом, что ДНК работает вниз.
   16. Присоединить провода для питания источника и выполнить 50-55 W. гель для примерно 3 ч или до бромфеноловый синий краситель фронт запустить по крайней мере 2/3 вниз гель.
4. Imaging гель
   Примечание: Этот гель очень тонкий и может быть трудно справиться. Большой осторожностью необходимо принять для предотвращения копирования и потери всего геля.
   Примечание: в зависимости от ДНК метку он может потребоваться использование различных гель томографах. Этот протокол использует инфракрасный флуоресцентных красителей и изображений образцов была исполнена на гель тепловизор (см. Таблицу материалы). Протокол написан специально для что тепловизор.
   1. При запуске бромфеноловый синий краситель фронт по крайней мере 2/3 вниз гель (~ 28 см), гель может быть прекращено путем выключения питания. Удалить гель от аппарата и место на Корк кольца.
   2. Отдельные пластины с разделительной плиты небольшой клин. Разместите разделитель на внутреннем углу вырезами подтянуть. Следует соблюдать осторожность и не использовать чрезмерной силы; пазы можно разорвать, если слишком много давления применяется.
   3. Попав всасывания между пластинами, осторожно поднимите верхнюю крышку и определить какие пластины, гель находится на. Если гель палочки на нижнюю пластину, снять верхнюю крышку и положите на Корк кольцо. Если гель на верхней пластине отмены, медленно двигаться и гель может отступить к нижней пластине. Если гель не подпадают, снова двигаться медленно потяните оставшуюся часть геля от нижней плиты и место верхней пластины с гелем на отдельном Корк кольцо.
   4. Как только разделены пластинами, увидеть, где на геля краситель и удалите избыток геля из верхней и нижней части геля. Как правило с нашей конструкции, используя 18 или 23 нуклеотида грунт и шаблон 45 нуклеотидов, существует не ДНК между бромфеноловый синий краситель передней и нижней части геля. Вырежьте вертикально от красителя в верхней части геля. Пробелы между краями геля и красителя также имеют не ДНК. И наконец вырежьте пару дюймов ниже хорошо пространства на геле. Существует не нуклеиновые кислоты на самом верху геля.
      Примечание: Резка гель в минимальный размер делает его значительно легче перенести на устройство обработки изображений. Если гель является слишком большим, это более восприимчивы к копирования во время передачи. Хотя мы часто отделка гель до изображения, рекомендуется использовать крайнюю осторожность при обрезке как соответствующие данные могут быть потеряны, если не позаботиться. Чтобы проверить ли удалены разделы содержат дополнительные данные, мы часто выполняют дополнительные проверки подакцизным порции геля для обеспечения, что данные не были потеряны.
   5. Слой геля с водой для предотвращения высыхания.
   6. Очистить поверхность тепловизор. С помощью задачи дворники, протрите поверхность с воды и этанола. Добавить тонкий слой воды на поверхность, где будет размещаться гель.
   7. Передавать нужную часть геля на мокрой поверхности Li-кор.
   8. Удаление воздуха пузырьки нежно прижимая их вне от геля, и протереть задачи стеклоочистителя. Осторожность, как это очень легко сорвать гель, нажав пузырьки воздуха слишком сложно.
   9. Изображение гель по заявлению производителя ' s протоколы. Анализировать гель с использованием доступного программного обеспечения для томографа.
   10. Хотя гель является изображаемого, очистить рабочее пространство путем устранения избыточного Полимерность гелей, промывки пластин и фильтрации буфере TBE выкладываемых.

Показаны успешные геля полиакриламида анализ качественную характеристику общей активности (описано в разделе 2.1, рис. 1) и кинетики устойчивого состояния (описанный в записке на завершение раздела 2.1, рис. 2). Анализ неудачного геля полиакриламида также показано (рис. 3).

Обратите внимание, что используется не коммерчески доступных лестница или молекулярных маркеров. Иногда мы будем использовать сочетание известных полимеразы субстрат для создания молекулярных маркеров; Однако важно отметить, что различные изменение нуклеотидов имеют очень разные электрофоретической подвижности, делая сравнения олигонуклеотиды одинаковой длины, но разные структуры нуклеотидов неуместным.

Рисунок 1: пример успешного геля полиакриламида анализа качественную характеристику общей активности. Обратите внимание, что отдельные полосы четко определенных и регулярных. Полосы представляют олигонуклеотиды различной длины; Этот гель позволяет легко сравнение между полимеразы. Нет фермента управления полосу, обозначается «-». Деятельность оценивается по длина продукции и часть помечены грунт, который преобразуется в больших продуктов. Из этого анализа E6 и E5 являются наиболее активными. E2 и E3 примерно равной активности, но меньше, чем E6 или E5, и Е4 и E1 являются наименее активных ферментов.

Рисунок 2: пример успешного гель для количественного анализа с помощью устойчивого состояния кинетики. Обратите внимание, что полосы хорошо решен и четко определены. Для определения константы скорости установившегося отдельных этапов синтеза олигонуклеотида, фермент инкубировали с различной количество аденозинтрифосфат нуклеозидов (в данном случае дЦТФ); Обратите внимание, что только n и (n + 1) Продукция синтезируются включение количественной оценки особых событий.

Рисунок 3: пример неудачного гель для общей активности. Во время обработки, что приводит к заметные пробелы в группах была сорвана геля. Обратите внимание, что гель полос неправильной формы, что затрудняет количественную оценку и анализ.

Здесь мы описали assay характеризовать синтеза ДНК полимеразы опосредованной M-ДНК. С помощью ближней ИК меткой ДНК грунты, а использование денатурируя электрофореза геля полиакриламида решить по-разному размера олигонуклеотиды, мы можем получить единичных нуклеотидных резолюции на олигонуклеотиды, позволяя точное измерение синтеза. Эти подходы могут использоваться либо измерить общую активность фермента (раздел 2.1) или для измерения параметров Михаэлиса-Menten отдельных шагов (Обратите внимание на следующий шаг 2.1). Наша лаборатория недавно использовал эти оба характеризуют ранее развивались ферменты⁹ , а также рационально инженерии ферментов¹⁰.

Наши анализы, описанные здесь отличаются от предыдущих методов их использования ярлыка нерадиоактивные ДНК. Исторически радиоактивность был использован для отслеживания синтеза ДНК из-за высокой чувствительностью, которые могут быть получены с помощью радиоактивного фосфора этикетки^11,18. К сожалению высокая стоимость утилизации, а также ограниченный срок хранения радиоактивных этикетки могут сделать использование радиоактивных меток непомерно. Здесь мы описывают использование ближней ИК-области Флюорофор помечены ДНК, которые не страдают от этих недостатков. В частности с флуоресцентными красителями ближней ИК-области мы видим аналогичные пределы обнаружения радиоактивно помечены ДНК (неопубликованные результаты). Однако с флуоресцентными красителями в видимом диапазоне, мы не смогли наблюдать подобные пределов обнаружения (неопубликованные результаты). Хотя наша группа обычно использует коммерчески подготовленные ДНК, принимая ближней ИК-области флуорофоров, эти красители совместимы с ряда установленных после синтеза 5' модификация химия, которые могут использоваться для установки этих ярлыков.

Краски люминесцентные, флуоресцентные ближней ИК-области выгодны также в том, что существует несколько коммерчески доступных цветов, которые могут позволить более сложных экспериментов, которые контролируют синтез двух помечены олигонуклеотиды в одном эксперименте. С радиоактивных этикетки эти виды многокомпонентных экспериментов не выполняются легко. Вероятно, это позволит ряд более сложных экспериментов, особенно для экспериментов ортогональных репликации.

Этот assay и любого анализа с использованием денатурируя электрофореза геля полиакриламида, главным образом ограничивается технической задачей выполнения электрофореза, низкая пропускная способность этих экспериментов, а также ограниченный размер диапазоны, которые наблюдаются в единичных нуклеотидных резолюции. Мы надеемся, что этот подробный протокол позволяет группам преодолеть технические проблемы этих анализов. В частности в то время как ограничения на пропускную способность assay, использование флуоресцентных меток ближней ИК-области увеличить пропускную способность, как он не требует от пользователя для разработки авторадиография. Однако гель по-прежнему занимает около 4-6 ч для установки и запуска, ограничивая количество экспериментов, которые могут быть запущены в день. Ограниченный диапазон вызвано электрофоретической возможности полиакриламида. Практически говоря, эти ограничения означают, что эти анализы являются лучшими для целенаправленного исследования вопросов, которые требуют единичных нуклеотидных резолюции.

Недавно высокая пропускная способность для секвенирования ДНК¹⁹ был использован чаще как метод характеризующие ДНК полимеразы^20,21. Эти анализы являются отметить для их резко повысить пропускную способность, которая позволяет более широкие вопросы, сосредоточены на последовательности предубеждения и ошибка спектров. Важно отметить, что в то время как высокая пропускная способность последовательности можно включить много параллельных экспериментов, он может быть сложным интерпретировать на основе единичных нуклеотидных. Это обеспечивает exciting возможность для анализов фермента, использованием электрофореза геля полиакриламида для заполнения пробелов в последовательности высокой пропускной способности, обеспечивая, что методы, описанные в этой статье актуальны на протяжении многих лет в будущем.

Авторы не имеют ничего сообщать.

Эта работа была поддержку корпорацией исследований для научного прогресса (Коттрелл колледж Scholar премии #22548) и TriLink биотехнологий (ResearchReward Грант #G139).