Инфузия протоков поджелудочной железы: эффективный и селективный метод доставки лекарств и вирусов

Инфузия протоков поджелудочной железы является важным методом, который может позволить отслеживать родословную, вводить гены и нацеливаться на клеточную линию. Здесь представлена методика инфузии протоков поджелудочной железы для доставки лекарств и вирусов к клеткам поджелудочной железы.

Поджелудочная железа является бифункциональным органом как с эндокринными, так и с экзокринными компонентами. Ряд патологий может поразить поджелудочную железу, включая диабет, панкреатит и рак поджелудочной железы. Все эти три заболевания отмечают активные направления исследования, не только для разработки немедленной терапии, но и для лучшего понимания их патофизиологии. Существует мало инструментов для дальнейшего развития этих областей обучения. Инфузия протоков поджелудочной железы является важным методом, который может позволить отслеживать родословную, вводить гены и нацеливаться на клеточную линию. Техника требует сложного рассечения второй части двенадцатиперстной кишки и ампулы с последующим окклюзией желчного протока и канюляцией протока поджелудочной железы. Хотя поначалу техника технически сложна, приложений множество. Неоднозначность в специфике процедуры между группами подчеркнула необходимость стандартного протокола. Эта работа описывает экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP) в поджелудочной железе после инфузии протока поджелудочной железы вирусного вектора, экспрессирующего GFP, по сравнению с фиктивной операцией. Инфузия и, следовательно, экспрессия специфичны для поджелудочной железы, без экспрессии, присутствующей в любом другом типе ткани.

Поджелудочная железа является бифункциональным органом, с эндокринными и экзокринными компонентами. Ряд патологий может поразить поджелудочную железу, включая диабет, панкреатит и рак поджелудочной железы^1. Все эти три заболевания отмечают активные направления исследования, не только для разработки немедленной терапии, но и для лучшего понимания их патофизиологии.

Целевой терапевтический метод доставки был бы полезен. Мы разработали методику инфузии протоков поджелудочной железы, которая является эффективным и селективным методом доставки лекарств и вирусов к клеткам поджелудочной железы. В этой модели проток поджелудочной железы избирательно канюлятируется, а общий желчный проток закупоривается, что позволяет доставлять исключительно в поджелудочную железу.

Этот метод может позволить проследить родословную конкретных типов клеток для дальнейшего выяснения путей развития, важных для развития поджелудочной железы и патологии^2,3. Различные промоторы в вирусных векторах позволяют специфически нацеливаться на клеточные линии и ввести гены в эти клеточные линии^4,5. Эта работа демонстрирует экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP) в поджелудочной железе после инфузии протока поджелудочной железы вирусного вектора, экспрессирующего GFP, по сравнению с фиктивной операцией.

Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по исследованиям и уходу за животными в Детской больнице Питтсбурга и Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Питтсбурга.

1. Предоперационная подготовка

1. Вводят ингаляционный изофлуран (1 - 3% для поддержания и до 5% для индукции) через носовой конус до соответствующего анестезирующего уровня. Следите за адекватностью анестезии путем ущемления щипцами. Отсутствие ответа считается адекватным, и обязательно не следует чрезмерно принять лекарства, так как может возникнуть угнетение дыхания.
2. Поместите животное на спину на сцену рассекающего микроскопа, с брюшком, центрируемым с учетом цели. Обездвижить животное хирургическим скотчем. Наносите офтальмологическую мазь на глаза животного, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
3. Нанесите гладкий толстый слой крема для удаления волос и оставьте на месте на 3 мин. Проверьте небольшой участок для удаления волос. Аккуратно протрите крем и волосы 70% пропитанной этанолом марлей.
4. Очистите и продезинфицируйте брюшко животного, протирая его 70% пропитанной этанолом марлей, а затем пропитанной бетадином марлей. Поддерживать стерильные условия на протяжении всей хирургической процедуры.

2. Правильная экспозиция

1. Сделайте разрез средней линии в коже от ксилоидного отроста до пупка с помощью скальпеля. Поднимите брюшину щипцами Адсона и сделайте ножницами небольшое отверстие в средней линии.
2. Удлините брюшинный разрез до длины разреза кожи, заботясь о том, чтобы оставаться на средней линии (linea alba).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это приведет к лапаротомии верхней средней линии брюшной полости.
3. Поднимите печень с помощью тупых втягивателей, чтобы обнажить общий желчный проток. Зажмите общий желчный проток изогнутым сосудистым зажимом бульдога.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот маневр предотвращает нежелательный вливание в печень.

3. Идентификация сосочков поджелудочной железы и дуоденотомия

1. Определите двенадцатиперстную кишку и с помощью щипцов Арруга втягивайте ее каудально, чтобы отобразить сосочек.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сосочек представляет собой белое пятно на передней поверхности второй части двенадцатиперстной кишки.
2. Втягиваете двенадцатиперстную кишку каудально, позволяя выявить течение протока поджелудочной железы. Иглой 301/2 калибра проколоть стенку двенадцатиперстной кишки по касательной, прямо напротив сосочки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Игла должна следовать тому же углу, что и проток, когда она входит в двенадцатиперстную кишко.

4. Настой.

1. Пропустите катетер через дуоденотомию, созданную на этапе 3.2, пока катетер не будет виден в протоке. Выдвигайте катетер в проток не более чем на 1 см, чтобы предотвратить обход второстепенных протоков притоков.
2. Зажмите катетер на месте вторым изогнутым сосудистым зажимом бульдога. Включите насос и влийте выбранный объем. Объем инфузии может варьироваться от 25 до 250 мкл, с идеальным объемом приблизительно 150 мкл.
3. Ввести внутрибрюшинную инъекцию примерно 1,5 мл физиологического раствора, чтобы компенсировать потери. Накройте открытый кишечник влажной марлей, чтобы предотвратить высыхание.
4. В конце инфузии снимите зажим бульдога, который удерживал катетер на месте. Используйте зажим бульдога, чтобы аккуратно удалить катетер из протока поджелудочной железы. Отпустите зажим из общего желчного протока.
5. Закройте брюшину и кожу в один или два слоя с помощью бегущего шва.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости закрывать дуоденотомию, так как она будет герметизироваться сама по себе.
6. В качестве послеоперационной анальгезии вводят дозу кетофена в 5 мг/кг во время процедуры и одну на следующий день.
7. Верните мышь в клетку под тепловой лампой, пока она не восстановится. Обеспечьте мышь пищей и водой ad libitum.
8. Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в достаточное сознание для поддержания грудины. Не возвращайте животное, перенесшего операцию, в компанию других животных до тех пор, пока оно полностью не выздоровеет.

5. Пробоподготовка

1. Поместите животное в углекислотную камеру или выполните вывих шейки матки.
2. Соберите поджелудочную железу, с селезенкой, печенью и двенадцатиперстной кишки в качестве контрольной. Зафиксируйте ткани в параформальдегиде на ночь при 4 °C. Криозащита образца в 30% сахарозы на ночь, как описано^{ранее 6.}
3. Заморозьте образцы. Срез ткани толщиной 6 мкм с помощью микротома. Выполняют визуализацию на микроскоп с флуоресцентной визуализацией, как описано^{ранее 7.}

При практике и тщательной хирургической технике выживаемость этих мышей должна быть больше 95%. Через неделю после инфузии желаемый эффект должен проявляться в поджелудочной железе. Мышей в возрасте от 10 до 12 недель использовали для инфузий протоков поджелудочной железы. Здесь мы используем аденоассоциированный вирус серотипа 8 (AAV8) с промотором ЦМВ для экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP) по сравнению с фиктивной операцией. Поджелудочную железу мышей собирали через 7 дней после инфузий. Участки поджелудочной железы, селезенки и двенадцатиперстной кишки окрашивали антителами к инсулину и Хештом. Рисунок 1 показывает, что существует обширная экспрессия GFP по всей поджелудочной железе у мышей, которые подверглись инфузии протоков поджелудочной железы с AAV8, в отличие от тех, кто перенес фиктивную операцию. У этих мышей нет экспрессии в печени, селезенке или двенадцатиперстной кишки, что документирует селективный характер инфузии. Эти данные могут быть подтверждены несколькими другими методами, включая профили экспрессии ДНК и РНК.

Рисунок 1. Экспрессия GFP после инфузии протоков поджелудочной железы. (a) Фиктивная хирургия по сравнению с (b) инфузией протоков поджелудочной железы с экспрессией GFP AAV8. Шкала представляет собой 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В этой работе подробно описывается методология инфузии протоков поджелудочной железы, эффективная мышиная модель для доставки генов и других молекул конкретно и эффективно в поджелудочную железу. Неоднозначность в специфике процедуры между различными группами высветила необходимость стандартизированного протокола^8,9,10.

Существует несколько критических этапов процедуры, начиная с отбора молодых, здоровых мышей. Перфорация двенадцатиперстной кишки, каким бы маленьким и контролируемым она ни была, является травматическим событием у мыши, которое, несомненно, приводит к набору воспалительных цитокинов и других факторов, которые не были полностью охарактеризованы. Поэтому деликатное рассечение имеет решающее значение, как и создание наименьшей дуоденотомии, возможной для введения катетера. Важнейшим этапом всей процедуры является канюляция протока поджелудочной железы с помощью системы родоразрешения.

Трудности могут возникнуть при чрезмерном нарушении работы сосочков поджелудочной железы, приводящих к подавляющей системной воспалительной реакции. Поджелудочная железа является тонким органом; в хирургическом сообществе он в разговорной речи описывается как орган, с которого не нужно «возиться». Показатели успеха будут варьироваться лишь незначительно в зависимости от уровня квалификации практикующего. До тех пор, пока желчный проток должным образом закупоривается, инфузия будет на 100% специфична только для поджелудочной железы.

Кривая обучения для процедуры довольно крутая, и основное ограничение преодолевается практикой. Как уже говорилось ранее, чрезмерные манипуляции с двенадцатиперстной кишки и поджелудочной железой могут привести к подавляющей воспалительной реакции, которую необходимо избегать.

Процедура имеет широкое применение во многих различных дисциплинах. Он может быть использован в качестве метода для целевой доставки генов с использованием специфических вирусных векторов^11. Процедура также может позволить специфическую инфузию молекул, которые помогают в выяснении функции клеток поджелудочной железы. Специфическая доставка определенных молекул является привлекательным методом модификации сигнальных путей внутри островков для получения пролиферации^12. Система также может ликвидировать необходимость трансгенного разведения путем непосредственного производства желаемого генотипа и фенотипа в поджелудочной железе. Приложений бесчисленное множество.

Авторам нечего раскрывать.

У авторов нет подтверждений. Финансирование было получено от Фонда Комиссии по здравоохранению и планированию семьи провинции Чжэцзян (грант 20146242) и Фонда Научно-технического бюро Вэньчжоу (грант Y20140248).