Стимуляция Signaling Notch у мышей предшественников остеокластов

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state.

Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.

This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Сигнализацию Паз путь млекопитающим является гомологичной к тому же пути в дрозофилы и состоит из четырех рецепторов трансмембранный надрезом (Notch1-4) и пять связанных с мембраной лигандов зазубренных (jag1 & JAG2) и дельта-типа (Dll1, 3, & 4) семьи ^1. Передача сигналов Notch инициируется , когда рецептор Notch на приемной клетке связана лиганда на передающей ячейки ^2. Во время этого транс-активации, лиганд Notch мембраносвязанная производит растягивающее усилие на рецептор Notch мембраной ^{3, 4.} Растягивающая сила связывания лиганда вызывает конформационные изменения рецептора Notch, которые облегчают внеклеточный расщепление рецептора с помощью TNF альфа-превращающего фермента (ТАСЕ) с последующим внутриклеточным событием расщепления, опосредованного пресенилин-содержащего гамма-секретазы комплекса (гамма-секретазы). γ-секретазы освобождает INT Notchracellular домен (NiCd), который транслоцирует в ядро, где он образует транскрипционной активации комплекса с CBF-1-Су (H) -Lag-1 (CSL), вдохновителя-подобный (MAML), и факторы конкретного типа клетки для того чтобы управлять экспрессией генов - мишеней ^5.

Механические элементы сигнализации Notch результате активации в необходимости уникальных методов активации пути Notch в пробирке. Растворимые лиганды Notch могут связываться с рецепторами Notch, но не приводят к растягивающих сил, необходимых для высвобождения NICD в то время как в то же самое время, конкурентно ингибировать связывание лигандов Notch клеточно-ассоциированной. Таким образом, добавление растворимых лигандов Notch в культуральной среде может ослабить нормальный Notch сигнализации ^{6, 7.} К счастью, лиганды Notch могут индуцировать высвобождение NICD , если они прикреплены к соответствующим жесткой подложке ^{5, 8, 9,10.} Посев клеток на лиганд-покрытием культуральных субстратах или нанесения лиганд-покрытием бусин в клетки могут одновременно активировать передачу сигналов Notch, и выбор между ними зависит прежде всего от желаемого времени стимуляции Notch. Для немедленного, временного активации сигнализации Паз, как можно было бы желательно во время средней точке функциональной или дифференцировки анализа, лиганд Выемка может быть связан с агарозном бисером, наносимые на культивируемые клетки, и вымываются в любое время. Для получения более устойчивой передачи сигналов Notch с начала периода культуры, культуры тканей пластины могут быть покрыты оболочкой с лигандом до начала посева клеток.

Для целей настоящего протокола, способы осуществляются с помощью мыши предшественников остеокластов, но способы и варианты способов , описанных здесь , применимы к широкому разнообразию типов клеток ^{6, 11, 12, 13, 14.} Остеокластов неизлечимо дифференцированные гемопоэтические клетки , которые построчная оплата ответственны за резорбции костной ткани, и они участвуют в многочисленных нарушениях потери костной массы ^15. Таким образом, в пробирке исследования дифференцировки остеокластов из их моноциты / макрофаги-линии дифференцировки предшественников и молекулярных механизмов , контролирующих их функция имеет важное значение для лучшего понимания остеокластов и развития новых костных-регенерирующий терапии. В то время как в настоящее время принято считать , что передача сигналов Notch играет положительную роль в дифференцировке и функции остеокластов, вариации в обоих Notch стимуляции сигнализации и остеокластов культуры и дифференциации предшественника привела к первоначально противоречивые выводы ^{16, 17, 18, 19.} Более тщательное изучение различий в методах и использования генетическихмодели значительно выяснена роль передачи сигналов Notch в остеокластогенеза, но применение стандартизованных стимуляции Notch и культуры методов может предотвратить такие споры в будущих исследованиях сигналов Notch в других типах клеток ^{20, 21, 22, 23.}

Существуют различные методы для культивирования и дифференциации мыши предшественников остеокластов, и, как и с различными методами стимул ции передачи сигнала Notch, лучший способ будет зависеть от экспериментального вопроса. В данном случае наш предпочтительный способ культивирования адгезивных и неадгезированных фракции клеток костного мозга вымывали из мышиных длинных костей будут представлены. Этот метод имеет то преимущество, что он не требует по существу отсутствие специализированного оборудования и продуцирующие клетки, которые применимы к различным методам дифференциации.

Все исследования с участием позвоночных животных проводилось в соответствии с протоколами, утвержденными в университете Пенсильвании Institutional уходу и использованию животных комитета (IACUC).

1. Культура Медиа Подготовка

1. Готовят -МЕМ путем растворения минимально необходимой среды (MEM) порошка и 1,9 г бикарбоната натрия в 900 мл H ₂ O и дополнения с 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 100 мл Тепло- инактивированной фетальной бычьей сыворотки. Стерилизовать с использованием 0,22 мкм полиэфирсульфон (PES) фильтр.
2. Готовят макрофага среду, дополнив -МЕМ с 35 нг / мл рекомбинантного мыши макрофаг-колониестимулирующий фактор (M-CSF)
3. Готовят остеокластов среду, дополнив макрофага среду с 100 нг / мл RANKL

2. Пересадка костного мозга Выделение клеток

1. Заполните один шприц объемом 10 мл с 25⅝ иглой на мышь с 10 мл альфа-MEM.
2. Эвтаназии мышей через 10 мин облучения CO ₂ при скорости потока 1,3 л / мин. Обеспечить смерть животных , следуя CO ₂ экспозиции с помощью цервикальной дислокации перед продолжением рассечение.
3. Используя чистую технику, рассекают и отделят голеней и бедрами. Лечить кожу мыши с 70% -ным этанолом , прежде чем сделать надрез вдоль передней поверхности каждой задней конечности , чтобы выставить берцовой и бедренной костями.
   1. Прорубленный коленного сустава, чтобы освободить дистального конца бедренной кости, и разрезают через бедра как можно ближе к тазу, как это возможно. Удалите бедренную кость и очистить как можно больше мягких тканей, как это возможно. Для того, чтобы удалить большую берцовую кость, прорезать лодыжки и удалить как можно больше мягких тканей, как это возможно.
4. Удерживая кости с пинцетом и перенесут мозга в 15 мл коническую пробирку с 2,5 мл комнатной температуры α-MEM, комбинируя флеши мозга от одной мыши в одну пробирку.
   Примечание: Успешный вровень мозг изменит окраску тон кость от красного до бежевого.
5. Разрешить мусора оседают на дно пробирки и переносят надосадочную жидкость в чистую 15 мл коническую трубку Осторожно, чтобы избежать переноса любого мусора.
   Примечание: Некоторые клетки могут также рассчитаться с мусором мозга. Если большее количество ячеек требуется, промывает мозг может быть отфильтрован через клеточный фильтр 70 мкм в чистую 15 мл пробирку.
6. Центрифуга трубки (с) при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы осадить клетки.
7. Вакуумная аспирация клеточный осадок супернатант и ресуспендируют в 0,5 мл аммоний-хлоридом калия (ACK) лизирующего буфера и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 3 мин, чтобы лизировать красные кровяные клетки.
8. Добавьте 10 мл PBS непосредственно в качестве АСК-клеточного раствора и центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин.
   Примечание: Теперь ранее красный осадок клеток должен быть бежевый.
9. Вакуумный аспирата супернатант и ресуспендируют осадок в 10 мл α-MEM, и пластины в 100 мм тканевой культуры обработанных блюдо с. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° С в увлажненнойтканевой культуры инкубатор.
   Примечание: Подсчет клеток не является необходимым для этого шага. В это время, адгезивные клетки из костного мозга будет оседают на поверхность культуры; неадгезивные популяции клеток костного мозга будет оставаться в виде суспензии. MCSF нет в культуральной среде в течение этой начальной инкубации.

3. Обогащение предшественников остеокластов

1. После ночной инкубации промывок мозга, передачи супернатанта культуры, содержащей неадгезированных клеток в 50 мл коническую трубку.
   Примечание: блюда культуры с адгезивными клетками, которые включают мезенхимальные клетки-предшественники костного мозга костей, могут быть отброшены или подпитывали свежей -МЕМ, если это необходимо для других экспериментов.
   Примечание: Остеокластов можно дифференцировать непосредственно из этих не прилипшие клетки костного мозга, высевая их в тканевых культур , обработанных блюд при плотности 4 × 10 ⁵ клеток / см ² в остеокластов среде и освежающий среды через день в течение 5 дней.
2. Добавьте -МЕМ к неприлипающими клеточного раствора до конечного объема 18 мл и добавляют M-CSF до конечной концентрации 35 нг / мл.
3. Добавьте 3 мл суспензии клеток каждого до 6 60 мм чашках суспензионной культуры.
4. Инкубируйте пластины в течение ночи при 37 ° С в инкубаторе для тканевых культур увлажненной. В течение этого времени, М-КСФ стимулирует дифференцировку макрофагов, которые могут прилипать даже без тканевой культуры обработанных поверхностей.
5. После инкубации в течение ночи, повторно подающие предшественников остеокластов с 3 мл свежей среды макрофагами. Это приведет к удалению, не прилипшие клетки, которые не дифференцируются в макрофаги.
6. Продолжают предшественников остеокластов культивирования при 37 ° С и 5% СО ₂ в течение 2 -х дней или до культуры достигают примерно 70% сплошности.

4. остеокластов Дифференциация

1. Промыть предшественников остеокластов с 5 мл PBS и обработать клетки с 1 мл морской происхождения протеолитической / коллагенолитического фермента при комнатной температуре до CELLs может быть смещена путем осторожного постукивания пластины.
   Примечание: предшественники остеокластов могут быть сняты только тогда, когда они культивируют в суспензионных блюд; Предшественники придавать слишком плотно к культуре ткани обработанной поверхности для подъема. Трипсин может активировать предшественников остеокластов и его следует избегать.
2. Добавляют 4 мл α-MEM в каждую чашку и передачи клеток в 50 мл коническую трубку. Граф клеток с использованием гемоцитометра и разбавленных клетки до плотности 5 × 10 ⁴ клеток / мл и добавляют M-CSF до конечной концентрации 35 нг / мл и RANKL до конечной концентрации 100 нг / мл.
3. Семенной клеток при плотности 2,6 х 10 ⁴ клеток / см ² в тканевой культуры обработанных пластин и инкубировать при 37 ° С в инкубаторе тканевых культур увлажненной в течение 2 -х дней. Дифференцировка обычно проводят в 24-луночных планшетах, где 5 х 10 ⁴ клеток высевали в каждую лунку.
4. Через 2 дня после начала дифференцировки, повторно кормовых клеток путем замены среды с 1 мл свежей osteocпоследняя среда.
   Примечание: остеокластов дифференциация как правило, будет завершена в течение 3-х дней. Полученные в результате остеокластов может быть ловушкой окрашивали для легкой количественной оценки и морфологического анализа.

5. Непрерывная стимуляция Signaling Notch с поверхностным покрытием Jagged1

1. Приостановка козьего антитела против человеческого Fc-области IgG антитела в PBS при концентрации 10 мкг / мл (1: 1000 разбавление 10 мг / мл стоковый). Добавить антитела решение поверхности культуры при плотности 1,3 мкг / см ² , и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа. В случае 24-луночные планшеты, добавляют 250 мкл (2,5 мкг) в каждую лунку.
2. Вакуумные аспирата скважин и залить 1 мл PBS. Повторите этот шаг 2 раза.
3. Приостановка рекомбинантный Jagged1-Fc слитого белка в PBS в концентрации 10 мкг / мл. Добавить раствор Jagged1-FC на покрытых антителами поверхности культурального при плотности 1,3 мкг / см ² , и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов. Поверхности культуры покрыты ONL антителY могут быть использованы в качестве контроля.
4. Вакуумные аспирата скважин и залить 1 мл PBS. Повторите этот шаг 2 раза. Хранить PBS в лунки до тех пор, незадолго до посева клеток, чтобы предотвратить их от высыхания.
5. Семенной 2,6 х 10 ⁴ предшественников остеокластов / см ² на поверхности с покрытием. передача сигналов Notch, будет непрерывно стимулировали в течение по крайней мере, 3-х дней.

6. Временная стимуляция Signaling Notch с бисером Jagged1 покрытием

1. Смешайте следующее в соответствующего размера трубки: 0,5 мкг / см ² Jagged1-Fc, 21 мкл / см ² белка G агарозном бусин, и PBS , до конечного объема 1,5 мл. Для того, чтобы подготовить достаточное количество шариков Jagged1 1 лунку 24-луночного планшета, смешайте 1 мкг Jagged1-Fc, 40 мкл белка G агарозном бисером и PBS до 1,5 мл.
2. Выдержите трубки с вращением на 4 ° C в течение 2 часов.
3. Центрифуга трубки при 300 мкг в течение 1 мин для осаждения шариков. Ресуспендируют бусины в 1,5 мл PBS. Повторите эту промывкуеще 2 раза.
4. Ресуспендируют Jagged1 бусины в 130 мкл см ² культуральной среды / и применить к культивируемым клеткам.
5. Инкубируйте клетки с бусинами при 37 ° С и 5% СО ₂ в течение требуемого периода. Удалите шарики с несколькими промывками PBS или культуральной среды.
6. Проверка Notch сигнализации активации с помощью измерения целевых Notch гена транскриптов ^10.

Цель этого метода заключается в культуре и стимулировать передачу сигналов Notch в предшественников остеокластов. При правильном культивировании, предшественники остеокластов обладают в основном удлиненную веретенообразную морфологию с гладкой цитоплазмы (рис 1А). Следует соблюдать осторожность, чтобы избежать иммунологической активации предшественников остеокластов. После активации прекурсоров распространяться и сплющенные с пенистой цитоплазмой (рис 1B). Эти "глазунья" клетки устойчивы к сигнализации RANK и не эффективно дифференцируются в зрелые остеокласты. Под правильной культуры и дифференциации условий, обогащенные предшественниками остеокластов будут дифференцироваться и сливаются в крупные TRAP-позитивные многоядерные остеокластов в течение трех дней (рис 1C).

Посев предшественников остеокластов на Jagged1-Fc поверхности, покрытые вверх регулирует гены-мишени Notch в течение 24 часов(Рисунок 2). Конкретные гены вверх-регулируемые с помощью передачи сигналов Notch варьироваться в зависимости от типа клеток. В случае предшественников остеокластов, наиболее преобладающий ген вверх регулируется Jagged1 является Hes1, хотя Hey2 и Мус умеренно повышающей регуляции, а также. Экспрессия других целевых Notch генов, таких как Hey1 и p21 существенно не изменяется с помощью Jagged1 стимуляции предшественников остеокластов.

Когда предшественников остеокластов культивировали в 24-луночных планшетах, лечение с бисером покрыты всего лишь 600 нг Jagged1-Fc демонстрируют значительное увеличение экспрессии Hes1 в течение 24 ч (рисунок 3). Через сорок восемь ч лечения показывают аналогичное увеличение экспрессии Hes1, хотя и в меньшей степени.

Рисунок 1: Культура и дифференциация предшественников остеокластов. (А)Наивные предшественники остеокластов культивировали с 35 нг / мл MCSF и без раздражений активации имеют гладкую, веретенообразную морфологию. Шкала бар = 25 мкм. (B) При иммунологической активации предшественников остеокластов принимает уплощенную, заполненный пеной морфологию и не дифференцируются в остеокласты. Для того, чтобы вызвать активацию, предшественники остеокластов обрабатывали 10 нг / мл липополисахарида в течение 16 часов. Шкала бар = 25 мкм. (С) иммунологическое наивные прилипшие предшественников остеокластов культивировали с 35 нг / мл MCSF и 100 нг / мл в течение 3 -х дней дифференцироваться в зрелые остеокласты. Зрелые остеокласты большие, многоядерные, и TRAP-позитивными. Шкала бар = 200 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: встречное регулирование целевых генов Notch в предшественников остеокластов высевали на иммобилизованным Jagged1-Fc. Предшественники остеокластов высевали на иммобилизованной Jagged1-Fc и культивировали в течение 24 часов. В течение периода культивирования экспрессия Hes1, Hey2, и мРНК Мус была увеличена. Другие целевые гены Notch, Hey1 и p21 не были изменены. Усы являются стандартная ошибка среднего значения, оценивали с использованием 1-хвостами тест т студента. *, Р <0,05. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: повышающая регуляция мРНК Hes1 в предшественников остеокластов , обработанных Jagged1-Fc бусин. 600 нг зазубренных-Fc, связанный с белком G агарозном бусин вверх регулирует экспрессию Hes1 в предшественников остеокластов, культивированных в лунку 24-луночного планшетав течение 24 часов после контакта. Hes1 индукция Jagged1 бусинок была сравнима с уровнями Hes1 индуцированных пластин Jagged1-Fc-покрытием. Другие целевые Notch гены, которые не были сильно индуцированные пластинами Jagged1-Fc покрытием не были оценены. Усы являются стандартная ошибка среднего значения, оценивали с использованием 1-хвостами тест т студента. *, Р <0,05. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Критические шаги в рамках протокола

Культура и в пробирке дифференциации предшественников остеокластов обеспечивает полезную платформу для исследования молекулярных механизмов остеокластогенеза и идентификации терапевтических мишеней для регенерации костной ткани и сохранения костной массы. При культивировании мыши предшественников остеокластов, наиболее важным элементом является поддержание предшественников в наивном состоянии. Как микрофагоподобных клетки, предшественники остеокластов загрунтованы реагировать на бактериальных компонентов и провоспалительных цитокинов. После активации предшественников остеокластов больше не будет эффективно дифференцируются в остеокласты. Основной причиной активации предшественника является наличие воспалительных цитокинов, таких как TNF, или ненадлежащим образом инактивируют комплемент в эмбриональной телячьей сыворотки. По этой причине, сывороток много должны быть испытаны на их способность поддерживать остеокластогенез перед использованием в экспериментах. Кроме того, все Сера используется в osteocпоследняя культура предшественником должна быть инактивированной нагреванием для денатурации дополнения, которые могут активировать предшественников остеокластов.

Модификации и устранение неисправностей

В этом методе Jagged1-Fc, используется для стимуляции сигналов пазом предшественников остеокластов. Слияние Fc с Jagged1 облегчает как иммобилизации на поверхности культуры с анти-Fc антитела и связывания с белком G бусин. Другие лиганды Notch, слитые с Fc, такие как дельта-Нравится1-Fc, могут быть использованы аналогичным образом. Следует отметить, что не все поставщики предоставляют отчетность рекомбинантного лиганда Notch активности. Таким образом, в то время как рекомбинантные лиганды Notch могут быть получены из нескольких поставщиков, следует позаботиться, чтобы получить биологическую информацию об активности у поставщика или испытаний лигандов в известных Notch лиганд-чувствительных клеток должны быть выполнены.

С помощью протоколов, описанных в данном методе позволяет конститутивной и временной стимуляции знака NotchAling в культивируемых предшественников остеокластов. Стандартный метод обнаружения активации сигнализации надрез Количественное мишеней Notch генов посредством количественного обратной транскрипции ПЦР (RT-КПЦР). Гены-мишени активируемых с помощью передачи сигналов Notch варьируются в зависимости от клетки, так что при стимуляции Выемка производится по типу ранее неохарактеризованной клеток, экспрессию панели канонических целевых Паз генов, таких как члены ГЭК и Эй семейство факторов транскрипции, должны быть определены. В более короткие сроки, активация Notch, потенциально могут быть обнаружены с помощью Вестерн-блот-оценки Notch внутриклеточный домен (NiCd). Следует соблюдать осторожность, тем не менее, так как есть четыре рецептора Notch и NICDs от различных рецепторов в различных типах клеток, не выбрасываются в той же степени, следующего лиганда стимуляции. Уровень НИИБ в клетках Notch-стимулированной также должны быть по сравнению с уровнями в нестимулированных клетках для учета исходных условий высвобождения NICD.

Ограничения метода

Хотя этот метод теоретически применима ко всем лигандами Notch, на сегодняшний день это только последовательно применяется с использованием Jagged1 и Дельта-Нравится1 ^{10, 20, 21.} Дальнейшее тестирование будет необходимо, чтобы определить, является ли дополнительные лиганды Notch поддаются этому методу. Этот метод также неспецифическое в активации рецептора Паз; оценка специфической активации рецептора Notch после стимуляции с помощью этого метода необходимо приписывать клеточные ответы на конкретные рецепторы Notch.

Значение метода в отношении существующих / альтернативных методов

Остеокластов дифференциация зависит на обоих остеокластов числа предшественника и предшественника остеокластов дифференциации потенциала. Оценка остеокластов дифференциации смешанных популяциях костного мозга не может различить изменения в остеокластов PRECursor количество и клеток автономной дифференциации потенциал. Обогащение предшественников остеокластов, предшествующих дифференциации контроля за различий в числах предшественников и позволяет более тесное опрос процесса дифференцировки остеокластов. Принимая во внимание, что передача сигналов Notch оказывает различные эффекты в различных точках во время остеокластогенеза, временной контроль как сигналов Notch и остеокластов дифференциации имеют важное значение для надлежащего исследования молекулярных путей он управляет.

Будущие приложения после освоения этой техники

При использовании этого протокола, оценка ролей для передачи сигналов Notch может быть выполнена не только в предшественников остеокластов, но потенциально в других типах клеток, а также. Изменением длины стимуляции и времени инициирования передачи сигналов Notch Notch, могут быть определены потенциальные мульти-фазные роли передачи сигналов Notch в различных клеточных процессов.

The authors declare that they have no competing financial interests.

This work was supported by the University of Pennsylvania Center for Musculoskeletal Disorders (5 P30 AR050950-09), a grant from the AO Foundation (S-16-12A), the Philadelphia VA Medical Center Translational Musculoskeletal Research Center, and an intramural orthopaedic surgery departmental research development fund. JWA is supported by the University of Pennsylvania Postdoctoral Opportunities in Research and Teaching (PENN-PORT) fellowship funded by the National Institute of General Medical Sciences Institutional Research and Career Development Award (IRACDA; 5 K12 GM081259-08).