Производство репликации ретровируса Дефектные от переходных Трансфекция 293T клетки

Этот метод демонстрирует эффективный способ подготовки к репликации дефектной ретровирусных запасов кодирования человека онкоген, а в дальнейшем использоваться для индукции миелопролиферативные заболевания в мышиной модели.

Наша лаборатория изучает человеческое миелопролиферативных заболеваний, вызванных такими как онкогены Bcr-Abl или фактор роста рецептора полученных онкогенов (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα и т.д.). Мы можем моделировать и изучать человека-подобного заболевания у нашей модели мыши, путем пересадки клеток костного мозга ранее инфицированы ретровирусом выражения онкоген интересов. Репликация-дефектных ретровируса кодирования человеческих онкогенов и маркера (GFP, ППП, ген устойчивости к антибиотику, и т.д.) производится переходных протокол трансфекции с использованием 293T клеток человеческого эпителия почечных клеточной линии преобразуется продукт гена E1A аденовирусов. 293 клетки обладают необычным свойством высокой степени transfectable кальция фосфата (КАПО _4), до 50-80% эффективности трансфекции легко достижима. Здесь мы сотрудничаем трансфекции клеток 293 с ретровирусных вектор выражения онкоген интересов и плазмиды, что выражает кляп-пол-ENV упаковки функций, таких как одного генома упаковки строит кат или PCL, в данном случае EcoPak плазмиды. Начальная трансфекции является дальнейшее совершенствование использования хлорохину. Запасы ecotropic вируса, собранная, как культура супернатанта 48 часов. после трансфекции, можно хранить при температуре -80 ° С и использовали для заражения клеточных линий с учетом трансформации и в лабораторных исследованиях, или первичные клетки, такие как мышиные клетки костного мозга, которые затем могут быть использованы для трансплантации в нашей модели мыши .

1. Вечером перед преобразованием, пластины 293T клетки в 3-5х10 ^{6 кл} / 6 см cultureplate ткани.
   
   Примечание: Мы используем клетки 293T за их простоту трансфекции и efficacyas вирусом клеток. Эти клетки являются несовершенными в упаковке вирус, если вспомогательную плазмиду вводят.
   
   
2. Первое утро, аккуратно удалите средних и заменить 4 мл 293T ячейки мед содержащий 25 мМ Хлорохин. Положить в инкубаторе в течение 1 часа.
   
   Примечание: пластина должна быть около 80% вырожденная.
   
   
3. Между тем, подготовка вирус решений смесь в течение 2 тарелки за раз, в 5 мл пробирок:
   1. 2 х 10 мг ретровирусных плазмиды построить
   2. 2 х 5 мг упаковка построить (EcoPak),
   3. 2 х 62 мл CaCl
   4. полный до 1 мл стерильной DDH ₂ O
      
      Примечание: При ретровирусных плазмида кодирует онкоген интересов и маркер, EcoPak кодирует кляп-пол-окр. Вместе с 293T клетки, они будут производить ecotropic ретровируса (RV), специфичные для клеток мыши, но не инфекционного для человеческих клеток. Оба Хлорохин и CaCl ₂ было показано, что повышение эффективности трансфекции.
      
      
4. Добавить 1 мл 2 раза sterileHBS каплям к смеси, мягко вортексе трубки.
5. Сразу же добавить это решение до 2 тарелки, 1 мл каждый, мягко, капля за каплей.
6. Положить в инкубаторе в течение 7 до 11 часов.
7. В вечернее время (от 7 до 11 часов. Позже), аккуратно удалите среды, и очень аккуратно заменить 5 мл свежего 293T среды. Положить в инкубаторе до полудня, на следующий день.
   
   Примечание: этот шаг важен, так как необходимо снять хлорохин из клеток. Если храниться в течение длительных периодов времени, хлорохин является токсичным. Решение в пластинах выглядит нечетким, в связи с очень тонкой, пылевидных осаждения трансфекции смеси.
   
   
   Примечание: Очень важно сделать все средства массовой информации изменения с особой нежностью, как клетки были сенсибилизированных хлорохин, и может легко отделить от пластины.
   
   
8. На следующий день, 18 до 24 часов. , прежде чем извлекать вируса (около полудня), аккуратно удалите среды, и очень нежно заменить 3 мл свежего 293T среды. Заменить в инкубаторе O / N.
9. Третье утро (от 18 до 24 часов. Позже), осторожно всасывать средний форму пластин с 10 мл шприца оснащен 18 G иглу. Это супернатант содержит ретровируса.
10. Изменение иглой 45 мм, шприц фильтра, переверните шприц несколько раз перемешать раствор хорошо, проходит через фильтр супернатант, и аликвоту в cryotubes
    
    Примечание: В качестве альтернативы, если вы делаете 3 + пластин вируса, бассейн все супернатанты же вирус в 5 0 мл коническую трубку. Тщательно перемешать, затем аликвоты супернатантов содержащей ретровирус в cryotubes с помощью фильтра.
    
    
11. Пробирки с вирусом полный супернатанты хранятся в -80 ° C до использования.

Четыре критических точек будет гарантировать успех хорошего вирусного складе:

1. 293T продуцирующие клетки должны быть очень здоровым, то есть они были разделены на очень регулярно, никогда не были заросшие, и высевают на оптимизированные плотностью 3,5-5 млн в 6 см планшета для культуры ткани, так что они достигают плотности 80% пластину на утро трансфекции.
   
2. Добавление хлорохин повышает эффективность трансфекции и последующих титр вируса, около 3 - 5-кратный, путем стабилизации клетка lysozomes и увеличения доли ДНК, которая достигает ядра. Натрий бутират (другой лизосомы стабилизатора) также используется для этой цели. Хлорохин может быть опущен, в этом случае меняется среда 7-11 часов. после трансфекции в этот момент не требуется.
   
3. Качества ДНК является очень важным. Предпочтительный метод очистки как вектор и упаковки плазмидных ДНК в два раза очищают CsCl-бромистый этидий плавучей центрифугирования плотности. Нам нравится концентрация ДНК, чтобы быть не менее 1 мг / мл, а отношение ОП 260/280 должна быть в пределах 1.75-1.90. Qiagen-очищенную ДНК также будет работать, хотя в руках авторов, результаты не столь хороши. Важно, что совокупный объем растворов ДНК малым (<50 мкл в целом на окончательное мл), чтобы избежать неблагоприятных последствий Трис и ЭДТА (ТЕ) по осадка фосфата кальция.
   
4. Выбор диапазона ретровирусных вектор и ведущий упаковки построить очень важны. Для устойчивых выражений в мышиных гемопоэтических стволовых клеток, вектора на основе вируса саркомы миелопролиферативные является предпочтительным. Общие основы вектор MIG Р.И., содержащие MPSV длинную последовательность повторить терминал, сайт множественного клонирования для внедрения онкоген, а ниже по течению внутренний сайт вступления рибосомы связаны с геном для улучшения зеленого флуоресцентного белка (EGFP). Для трансдукции мыши HSC, вирус с ecotropic круг хозяев является оптимальным, но такие акции нестабильны при физиологической температуре и не могут быть сосредоточены центрифугированием.
   

Некоторые контрольно-пропускных пунктов: При желании, когда-то собирают, 293 клетки могут быть использованы для производства белка лизатов для иммуноблоттинга проверить экспрессию белков, кодируемых ретровирусных вектор (например, ТК). Мы также используем контроль LacZ кодирования плазмиды в отдельную табличку во время трансфекции (без упаковки вектора необходимо), чтобы проверить для трансфекции efficinecy бета-гал анализа, когда мы собираем супернатанта других плит. Обратите внимание: это будет тест клеток и реагентов, но не качество плазмиды используются для вируса решений.

Перед использованием любого вируса, титр должен быть определен. Это очень важно для того, чтобы соответствовать титры различных акций вирус в тот же эксперимент, и для обеспечения эффективного трансдукции гемопоэтических стволовых клеток.