Novel Выделение РНК-связывающих белков Стремительное Методология

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

РНК-связывающие белки (ОДП) составляют около 10% от S. CEREVISIAE белки ^1,2 и около 15% белков млекопитающих ^3-5. Они участвуют во многих клеточных процессах, таких как мРНК пост-транскрипционной обработки и регулирования, перевод, биогенеза рибосом, тРНК аминоацилирования и модификации, хроматина и многое другое. Важной подгруппой ОДП является мРНК-связывающие белки (mRNPs) ^6,7. В процессе созревания мРНК, различные ОДП связывают расшифровку и урегулируют свою ядерную переработку, экспорт из ядра, клеточной локализации, трансляции и деградации ^6-8. Таким образом, определенный набор ОДП, связанных с конкретным транскрипта в любой момент времени определяет его обработки и в конечном счете его судьба.

Идентификация ОДП, связанных с мРНК может значительно улучшить наше понимание процессов, лежащих в основе их пост-транскрипционной регуляции. Различные генетические, Микроскопические, биохимические и биоинформатики методы были использованы для идентификации белков , участвующих в регуляции мРНК (обзор ^9-11). Тем не менее, лишь немногие из этих методов позволяют идентифицировать белки, связанные с конкретной мРНК-мишени. Следует особо отметить Дрожжи Три Гибридная система (Y3H), которая использует мРНК представляют интерес в качестве приманки для скрининга библиотеку экспрессии в клетках дрожжей. Положительные клоны, как правило , наблюдается через выражение выбора роста или репортера ^12-14. Основным преимуществом этого метода является большое количество белков, которые можно сканировать в сотовой среде и способность измерения силы взаимодействия РНК-белок. Недостатками включают относительно большое число ложных положительных результатов из-за неспецифического связывания, а также высокий потенциал ложных отрицательных результатов из-за, в частности, до неправильного сворачивания от добычи слитого белка или РНК приманки.

Альтернативой генетического подхода является сродство purifiКатион РНК с его ассоциированных белков. Поли А-содержащий мРНК, могут быть выделены посредством использования олиго дТ колонн, и их ассоциированные белки обнаруживаются с помощью масс-спектрометрии. Взаимодействие РНК-белок сохраняется в клеточном контексте путем сшивания, что делает малой дальности ковалентные связи. Использование олиго дТ колонке дает общее представление о всей протеома , который связан с любым поли - А-содержащей мРНК ^3,5,15. Тем не менее, это не дает список белков, которые связаны с определенной мРНК. Очень немногие из них будут доступны для выполнения такой идентификации. Метод ПАР влечет за собой трансфекцию нуклеиновой кислоты с комплементарности мРНК - мишени ^16,17. Нуклеиновая кислота также присоединен к пептиду, который позволяет сшивающего ОДП в непосредственной близости от сайта взаимодействия. После сшивания, КПБ-пептид-нуклеиновая кислота может быть выделена и подвергнута анализу протеомики. В последнее время методология аптамеры на основе былауспешно применяется для извлечения из клеточных линий млекопитающих ^18. РНК аптамеров с улучшенным сродством к стрептавидином была разработана и слиты с последовательностью, представляющей интерес (АС богатых элемент (ARE), в данном случае). РНК аптамеров-ARE была присоединена к стрептавидином бус и смешивают с лизата клеток. Белки, которые связаны с последовательности были очищены и идентифицированы с помощью масс-спектрометрии (МС). Хотя этот метод обнаружены ассоциации , которые имеют место вне клеточных параметров (то есть, в пробирке), то, вероятно, будет изменен в будущем , с тем , чтобы ввести аптамеров в геном и , таким образом , позволяют выделение белков , ассоциированных с мРНК , в то время как в клеточная среда (то есть, в естественных условиях). У дрожжей, где генетические манипуляции хорошо установлена, экспрессный метод (разработан в лаборатории профессора Джеффа Джерст в) обеспечивает представление ассоциаций ¹⁹ в естественных условиях. RAPID сочетает в себе конкретное и сильное связывание белка MS2 пальто (MS2-CP) в РНК последовательности MS2, и на стрептавидин-связывающий домен (СБП) с стрептавидином гранулами, конъюгированными. Это обеспечивает эффективную очистку MS2-меченых мРНК через стрептавидином бусин. Кроме того, выражение 12 копий петель МС2 позволяет использовать до шести MS2-ХП связываться одновременно с РНК и повышение эффективности ее изоляции. Таким образом, этот протокол был предложен для того, чтобы идентифицировать новые мРНК-ассоциированных белков, как только элюированные образцы подвергали анализу протеомики с помощью масс-спектрометрии.

Недавно мы использовали RAPID для идентификации новых белков , связанных с дрожжами Pmp1 мРНК ^20. Pmp1 мРНК ранее показано, что связано с ER мембрану и обнаружили , что его 3 'нетранслируемой области (UTR) , чтобы быть главным фактором , определяющим в этой ассоциации ^21. Таким образом, ОДП , которые связывают Pmp1 3 'UTR, вероятно, играют важную роль в его локализации. RAPID с последующей жидкостной хроматографY-масс - спектрометрии / масс - спектрометрии (ЖХ-МС / МС) привело к идентификации многих новых белков , которые взаимодействуют с Pmp1 ^20. Здесь мы приводим подробный протокол методологии RAPID, важные элементы управления, которые должны быть сделаны, и технические советы, которые могут улучшить урожайность и специфичность.

Примечание: Вставьте последовательность, состоящую из 12 MS2-сайты связывания (МС2 петель; MS2L) в желаемый геномного локуса, как правило, между открытой рамкой считывания (ORF), и 3'-UTR. Подробный протокол для такой интеграции обеспечивается в другом месте ^22. Проверьте правильность вставки и экспрессии с помощью ПЦР, северного анализа или RT-PCR ^20,23. Важно, чтобы убедиться, что интеграция не вмешивались с синтезом 3'UTR. Кроме того, плазмиду , экспрессирующих МС2-СР , слитый с СБП под выражением (истощением метионин) индуцируемый промотор , также должны быть введены в клетки ^24. Идентичный штамм, за исключением введенных петель MS12, следует использовать в качестве контроля для обнаружения неспецифических сигналов.

1. Очистка RAPID

1. Grow 500 мл дрожжевых клеток (используют 250-1,000 мл дрожжевых клеток в зависимости от уровня экспрессии представляющего интерес гена) , выражающая МС2-меченый мРНК ²⁰ иMS2-CP-GFP-СБП слитый белок от ²⁴ до OD ₆₀₀ 0,8 - 1,0 при 30 ^о С в соответствующей среде роста (например, синтетический Декстроза (SD) селективной среде).
2. Центрифуга клетки при 3000 мкг в течение 4 мин при комнатной температуре и отбросить супернатант.
3. Промыть клетки в 1X фосфатным буферным солевым раствором (PBS), центрифугируют , как и раньше (шаг 1.2), ресуспендируют в равном объеме (этап 1.1) УР без метионина, и инкубировать в течение 45 - 60 мин при 30 ^° С , чтобы вызвать экспрессию MS2 -СР-GFP-СБП слитый белок.
   Примечание: Более длительное время индукции может привести к агрегации GFP.
4. Отложите 10 мл клеток и экстракта РНК из этого образца с использованием простого "горячего фенола" метод ^25. Внимание: Фенол является высокотоксичным и должны быть обработаны в соответствии с его инструкциями по технике безопасности.
   Примечание: Эта РНК является хорошим ориентиром для качества выделенной РНК (рис 1А).
5. Для получения 500 мл клеток, добавляют 1,35 мл 37% формальдегида до конечной Concentration 0,1% сшивать РНК-белковых комплексов. Продолжить инкубации при 30 ^° С в течение 10 мин. Внимание: Формальдегид обладает высокой токсичностью и должны быть обработаны в соответствии с его инструкциями по технике безопасности.
6. Добавить 26,5 мл 2,5 М глицин до конечной концентрации 0,125 М и инкубировать в течение 3 мин, чтобы остановить сшивку. От этого шага дальше, все расставит на льду, чтобы минимизировать деградацию РНК.
7. Центрифуга клеток при 3000 мкг в течение 4 мин при 4 ^° С и промывали 45 мл холодного 1x PBS.
8. Ресуспендируют клеток в 1 мл буфера для лизиса RAPID на 100 мл исходной клеточной культуры.
9. Разделить на порции по 500 мкл в завинчивающейся крышкой микроцентрифужных пробирки и добавляют ~ 400 мг охлажденных стеклянных шариков в каждой аликвоты (примерно полная 0,2 мл ПЦР трубки).
10. Лизировать клетки в бусинки с насадкой в ​​течение 3 мин. Немедленно поставить лизата на льду.
    Примечание: лизис клеток-релизы в клеточные РНКазы, которые являются основной причиной деградации РНК. RAPID буфера для лизиса содержит высокую концентрацию РНКазы inhibitors, такие как неспецифический ингибитор гепарин РНКазы и специфических ингибиторов. Работая быстро и держать все холодным также рекомендуется.
11. Переносят лизат в новые пробирки. Пирс небольшое отверстие в нижней части каждой трубки с микроцентрифуге горячей иглой (0,8 мм х 40 мм) и поместите микроцентрифуге трубки в верхней части 15-мл пробирки. Используйте голову 5 мл шприца в качестве переходника между микроцентрифужных труб и 15 мл пробирки. Центрифуга сборку труб при 3000 х г в течение 1 мин при 4 ^° С ,
12. Перенести проточного из 15 мл трубки к новой 1,5 мл пробирку и центрифугируют при 10000 х г в течение 10 мин при 4 ^° С для удаления остатков клеток.
13. Бассейн супернатанты от всех 1,5 мл пробирки в одну 15 мл трубку и отложите 1/50 и 1/100 объем лизата для РНК и выделения белка, соответственно.
    Примечание: Они будут служить в качестве "Ввод" образцов для последующего анализа (рисунок 1).
14. Добавьте 300 мкг авидина на 500 мл Initial культуры дрожжей и инкубировать в течение 30 мин (это может быть уменьшено до 10 мин) при температуре 4 ^° С при постоянном прокаткой (10 оборотов в минуту).
    Примечание: авидин блокирует биотин и биотинилированные белки от связывания с стрептавидином бусин.
15. Предварительно вымыть стрептавидином шарики до инкубации с лизатом клеток.
    1. Помещают около 300 мкл стрептавидина бусин суспензии до 1,5 мл трубки микроцентрифужных и снимите верхнюю супернатант. Это приведет к 250 мкл шариков. Вымойте бисером дважды 1 мл буфера для лизиса RAPID. Центрифуга стрептавидином шарики при 660 мкг в течение 2 мин при 4 ^° С между каждым шагом.
    2. Блок бусин путем инкубирования в течение 1 ч с 0,5 мл буфера для лизиса RAPID, 0,5 мл 10 мг / мл бычьего сывороточного альбумина и 10 мкл 10 мг / мл дрожжевой тРНК. Шарики могут быть оставлены O / N в блокирующем растворе при 4 ^° С с вращением при необходимости.
    3. Промыть дважды с 1 мл RAPID буфера для лизиса.
       Примечание: магнитные гранулы также могут быть использованы для уменьшения времени и backgrкруглый вырез. Они, однако, имеют меньшую емкость, чем сефарозы.
16. Добавьте 250 мкл предварительно вымытых стрептавидином бисером авидин-содержащий лизата (со стадии 1.14) и инкубировать 1 час при 4 ° C с постоянным вращением (10 оборотов в минуту).
    Примечание: Это время инкубации представляет собой компромисс между обеспечением достаточного времени связывания и свести к минимуму шансы деградации РНК.
17. Центрифуга при 660 х г в течение 2 мин при 4 ^° С , чтобы очистить стрептавидином шарики и перенести супернатант в новую 15 мл трубки. Отложите 1/50 и 1/100 объема лизата для РНК и белка изоляции, соответственно.
    Примечание: Это будут "несвязанные" образцы.
18. Вымойте бисером с 1 мл RAPID буфера для лизиса, слегка встряхните, переход на новую 1,5-мл микроцентрифужных трубки, и центрифуга, как на этапе 1.17. Повторите этот шаг три раза.
19. Вымойте бисером с 1 мл буфера RAPID мыться, и на этот раз вращаться (10 оборотов в минуту) в течение 5 мин при 4 ° С. Повторите этот шаг дважды.
20. Вымойте бисером с 1 мл 1x PBS и центрифуге, как указано выше.
21. Вымойте бисером раз с 120 мкл 1x PBS. Центрифуга, как описано выше, и взять на себя всю супернатант для РНК и извлечения белка в качестве образца "Wash".
    Примечание: Этот последний образец стирки будет указывать строгость промываний и должна быть того же объема, что и образец элюции. Это упростит обработку и загрузку в последующих анализах.
22. Для элюирования РНК и РНК-ассоциированных белков из колонки, добавляют 120 мкл 6 мМ биотина в 1X PBS и инкубировали в течение 45 мин при температуре 4 ° С при постоянном вращении (10 оборотов в минуту).
23. Центрифуга гранулы, как описано выше, и передать элюированный материал на новый 1,5 мл трубки. Спин элюированный образец снова и перенести верхнюю фазу к новой 1,5 мл трубки, чтобы исключить унос бисера.
24. Возьмите образцы для РНК или экстракции белка.
    Примечание: Объем взят должен зависеть от следующего анализа и уровень экспрессии РНК или белка, представляющего интерес, В качестве ориентира для северного анализа ^26, принять 80% выборки, для Вестерн - блоттинга ^23,27 или RT-PCR ^28, принять 20%, а для масс - спектрометрии ²⁹ , чтобы обнаружить новые белки, взять весь образец.

2. Экстракция РНК

1. Добавить равный объем 2x Сшивание Реверсирование буфера и инкубируют в течение 45 мин при 65 ° С. Продолжить непосредственно для экстракции РНК.
   Примечание: сшивающий Реверсирование буфер содержит этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), что существенно повышает экстракции РНК ^20.
2. Используйте стандартный фенол: хлороформ метод ²⁶ для извлечения РНК из "входа" и "несвязанных" образцов (шаги 1.13 и 1.17).
   Примечание: Эти образцы содержат большое количество ингибитора РНКазы гепарина, который может ингибировать последующее обратное Transcriptase- (RT) с использованием анализов (например, RT-PCR), поэтому, LiCl осадков ³⁰ рекомендуется , чтобы удалить его. "ВаSH "и" элюции "образцы (шаги 1,21 и 1,24) содержат малые количества РНК и осаждают с помощью следующих шагов.
3. Добавить равный объем 8M гуанидин-HCl (GuHCl) и два объема 100% этанола к "промывкой" и "вымывания" образцов. Инкубируют при температуре -80 ° С в течение по меньшей мере 2 ч.
   Примечание: гуанидин будет эффективно денатурации белков и, таким образом, ингибируют РНКазы и протеазы в образце.
4. Центрифуга при 20000 х г, 4 ° С в течение 30 мин и отбросить супернатант. Промыть гранулу с холодным 80% этанолом и снова центрифуге при 20000 х г, 4 ° С в течение 15 мин.
5. Растворить осадок РНК в 400 мкл РНКазы свободной воды и выпадают в осадок снова, чтобы удалить остатки GuHCl или другие загрязняющие вещества. Добавить 40 мкл 3 М ацетата натрия, рН 5,2 и 800 мкл 100% этанола, инкубируют при -20 & deg; С в течение по меньшей мере 1 ч.
6. Центрифуга и мыть, как на стадии 2.4 и удалить все этанол с наконечником 10 мкл. Ресуспендируют РНК Пелли др в 10 мкл РНКазы свободной воды. Соблюдайте особую осторожность, так как осадок РНК, как правило, не видно.
   Примечание: Образцы могут быть использованы для Нозерн - анализа , как описано в ²³ (фиг.1).

3. Получение белка для Вестерн-блот или масс-спектрометрического анализа

1. Добавьте 1/3 объема 4x Laemmli буфера выборок (LSB) для образцов белка и инкубировать 45 мин при 65 ° С, чтобы полностью изменить сшивание РНК и белков.
   Примечание: Образцы можно хранить при -20 ° С.
2. Запуск белки на полиакриламидном геле (SDS-PAGE) ^31. Скорректировать процент геля в зависимости от размера белков, которые необходимо проанализировать.
   Примечание: 10% гель акриламид дает широкий спектр разделения и хорош в качестве первого приближения.
3. Перенос белков на мембрану , как в стандартном анализе иммуноблот ²⁷ для контроля эффективности изоляции (Рисунок 1С). Пятно либо кумасси голубым R250 или окрашивания серебром перед анализом масс-спектрометрии.
   Примечание: Серебро пятно является предпочтительным выбором , поскольку он является более чувствительным и позволяет лучше обнаружения (рис 1B). Окрашивание можно сделать с помощью либо вручную приготовленных растворов или коммерческих наборов. Время инкубации геля в растворе окончательного красителя должно быть определено экспериментально. Длинные инкубации может выявить низкие обильные белки, но может привести к весьма выраженные белки, такие как MS2-CP-СБП-GFP, чтобы быть более окрашена и могут маскировать окружающие белки в их окрестности. Кроме того, высокий фон может произойти. Внимательно следить за реакцией, и добавить стоп-раствора в соответствующее время.
4. Вырежьте полосы из геля и передавать их в 1,5 мл пробирки. Образцы хранить при температуре -20 ° С, или отправить для экстракции белка и усвоением трипсина с последующим анализом ЖХ-МС / МС ^32.
5. В качестве альтернативного подхода протеомического исключить стадию разделения геля, переваривать элюированный материал с шага 1,24 в таклюция с помощью трипсина и с учетом анализа LC-MS / MS ^33.
   Примечание: Опуская разделение SDS-PAGE упрощает протокол и повышает урожайность. Тем не менее, образцы могут содержать следы моющего средства NP-40, ингибирующего масс-спектрометрический анализ. Чтобы преодолеть эту проблему, выполните следующие действия:
   1. Запуск белка на SDS-PAGE ³¹ за 10 - 15 мин.
   2. Вырежьте всю часть переулка (то есть, где белки расположены).
      Примечание: образец белка может включать значительное количество белка МС2-CP-SBP, которые могут затенить сигналов низкого белков изобилии.

RAPID делает возможным выделение специфической РНК-мишени с ее ассоциированных белков. Критическое для его успеха является сохранение РНК нетронутыми как можно больше, в результате чего получают достаточное количество белков. Для определения эффективности изоляции и качества РНК, Нозерн - анализ выполняется (рисунок 1А). Северный анализ имеет преимущество непосредственно отчетности эффективности и качества стремительной. Таким образом, относительные количества полной длины и продуктов разложения может быть определена за один проход. Рибосомных РНК (рРНК), которые легко обнаружить в окрашивания бромистым этидием, а также отсутствие рРНК в образце элюирования указывает строгость очистки. Жесткость и специфичность очистки дополнительно свидетельствует отсутствие сигнала немаркированного мРНК в образцах элюции (СИГН1 нижняя панель). Кажущаяся сигнал в полосе FPR1, которая не имеет размера ACT1, является пережитком предварительнодущих гибридизацию с зондом MS2L. Северный анализ также показывает, что входной РНК является несколько более деградировали по сравнению с РНК, которые очистили горячим протоколом фенол (C / O ACT1 зонда панели). Это связано с более длительными и сложного RAPID протокола. Тем не менее, значительное количество полнометражных, помеченный РНК выделяют конкретно, как показали сильный сигнал в элюции фракции (MS2L зонд).

Образцы белка могут быть запущены на SDS-PAGE и окрашивали серебром пятна перед анализом протеомики (рис 1B). Образец изолированы от контроля, немаркированные клетки (-MS2L) полезно при различении неспецифических ассоциаций из РНК-зависимых единиц. Таким образом, только полосы, которые сильнее в меченой пробе (+ MS2L) вырезают из геля и принять за LC-MS / MS. Вестерн - анализ с общими ОДП также рекомендуется указывать эффективность белка совместного очистки (рис1С). При этом мы использовали Yef3, который , как известно, взаимодействуют с Pmp1 ²⁰ или GFP, что указывает на общую эффективность и специфичность изоляции. Интересно отметить, что эффективность Yef3 изоляции, как представляется, отличаются между Pmp1 и FPR1, и значительно ниже по сравнению с GFP.

Рисунок 1. Удельная Выделение MS2L-меченых РНК и идентификация белков , ассоциированных с . Результаты двух различных РНК , которые были подвергнуты RAPID (Pmp1 и FPR1) представлены. (А) Северный анализ образцов РНК , выделенных из быстродействующего эксперимента блот. РНК подвергали электрофорезу на агарозном геле, и окрашивали бромистым этидием (верхняя панель). Гель переносили на нейлоновую мембрану и подвергали гибридизации с указанными зондами (нижние панели). Исследуемые образцы: быстро лизис клеток (горячий фенол [шаг 1,4]), RaЛизис клеток PID (вход [шаг 1.13]) и после элюирования с биотином (элюирование [стадии 1,24]). (В) Серебро пятно белков из RAPID с MS2-меченых и немаркированные клетки. Образцы белка из элюированных фракций МС2-меченого Pmp1 (+ MS2L) или немаркированной управления (-MS2L) запускались в SDS-PAGE и окрашивали серебром. Полосы с дифференциальной интенсивности (помечены звездочками) вырезали из геля и определяли анализом масс-спектрометрии. Стрелка указывает на гибридный белок MS2-CP-GFP-SBP, который демонстрирует равную нагрузку белка. Ненужные полосы были обрезаны для ясности. (C) Западный анализ положительного контроля. был проведен Вестерн-блот с антителами, которые распознают Yef3 или GFP фрагмент гибридного белка МС2-CP. Ненужные полосы были обрезаны для ясности. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Различные методы используют выделение специфических мРНК для выявления связанных с ними белков ^{11,34 35.} Эти методы применяются в пробирке и в естественных условиях стратегий для исследования РНК-белковых взаимодействий. В пробирке методы инкубировать экзогенно транскрипции РНК с лизатом клеток , чтобы захватить ОДП и изолировать RNP комплексы ^36,37. Был представлен эффективный подход такого типа в последнее время , что позволило выявить новых белков , которые связываются с регуляторной РНК мотив ^18. Недостатком этих методов является связывание неспецифических ОДП , поскольку объединение происходит вне клеточной среды. В естественных условиях методы, в которых белки сшиваются в то время как в естественных условиях, может обеспечить более полное представление о РНК-белок ассоциации. Кроме того, сшивка позволяет более высокую жесткость при изоляции и, следовательно, более высокую специфичность. ПАРЫ подход ¹⁷ использует трансфекцию антисмысловойПоследовательность к РНК-мишени, с тем, чтобы направить пептидный фрагмент в непосредственной близости от ОДП. Пептид-ОДП может затем быть сшитым и изолированы с помощью бус, которые связаны с последовательностью, комплементарной антисмысловой последовательности. Методология ПАР очень выгодно из-за его простое приложение для многих типов клеток без необходимости в сложных геномных манипуляций. Это, однако, зависит от эффективности трансфекции, и случаи, когда низкий процент клеток принимают антисмысловой будет иметь низкую эффективность. Кроме того, выделение последовательности РСП-пептид-антисмысловой получают посредством магнитных стрептавидином бусин, которые связаны с биотинилированным олигонуклеотидом, комплементарным антисмысловой нуклеиновой кислоты. Множественность взаимодействий (магнитные шарики, стрептавидин-биотин и спаривания оснований) может ограничить строгость и эффективность изоляции. Стремительное метод , описанный здесь ²⁴ обеспечивает альтернативу этим ограничениям в нескольких аспектах. Во-первых, тон интеграция MS2 петель в геномную локусы гарантирует, что все клетки экспрессируют его, тем самым увеличивая его выход. Во- вторых, она использует высокое сродство взаимодействие MS2-CP-GFP-СБП до двенадцати МС2 последовательностей петли и позволяет им связываться в естественных условиях. В-третьих, фиксация взаимодействия РНК-белок обеспечивает более строгие промывок и уменьшает идентификацию неспецифически связанных белков. И, наконец, домен СБП связывает стрептавидином бусинки с высоким сродством и легко элюирование свободного биотина.

Вставка цикла MS2 в РНК желательно между ORF и 3'-UTR, чтобы свести к минимуму перевода возмущение и обеспечить экспрессию всех петель. От шести до 24 MS2 цикл повторяется ранее использовались для визуализации локализации мРНК ^38-40. Тем не менее, введение длинной последовательности MS2 петли могут вызвать изменения в обработке и структуре РНК; это может дестабилизировать транскрипт или изменить репертуар ОДП связанныйк нему. По нашему опыту, 12 петель достаточно , чтобы получить эффективное элюирование MS2-меченой РНК ^20. В связи с этим, мы отмечаем, что мы обычно наблюдали дополнительные короткие транскрипты в наших северных скрещиваний. Северный анализ с различных зондов показали , что эти короткие формы включали MS2L и часть 3 'UTR ^20, что свидетельствует о преждевременной терминации транскрипции. Такие случаи могут снизить эффективность выделения белков, ассоциированных с UTR 3 '. Таким образом, число вставленных петель и их расположение в пределах РНК должны быть сбалансированы между высокой эффективностью спуском и стабильности транскрипта.

РНК должна оставаться нетронутыми на протяжении протокола для обеспечения эффективной изоляции и обнаружение максимального множества связанных белков. Шансы на внешних загрязнений РНКазы может быть уменьшена в перчатках, обеспечивая чистую рабочую зону, готовя раствор с РНКазы водой, и работает сжатои эффективно сократить время протокола. Тем не менее, мы обнаружили, что наибольший вклад в деградацию РНК является высвобождение клеточных РНКазами к лизата после лизиса клеток. Было предложено криогенного измельчения дрожжевых клеток с механическими результатами мельница в улучшенной очистки РНК ^41. Это можно судить в тех случаях, когда наблюдается значительное ухудшение с этим протоколом.

Общим недостатком ниспадающих анализов является выделение многочисленных белков, которые связываются неспецифически с колонкой. Таким образом, применение штамма дрожжей с немаркированной РНК является важным контроль. Этот штамм экспрессирует слитый белок MS2-CP-GFP-SBP для дальнейшего исключения белки, которые связываются с слитого белка и не РНК-мишени. Заметим , что это не исключает белки , которые могут связываться сам цикл MS2, и они нуждаются в дальнейшей проверке с выпадающим анализа белка. Фигура 1В показывает , что мы смогли идентифицировать несколько белков , которые связываютсяконкретно мРНК Pmp1, и некоторые из них были впоследствии подтверждены с помощью совместного анализа IP - ^20.

Стремительное методология в настоящее время ограничивается дрожжевых систем, используя свои хорошо зарекомендовавшие конкретных участков методологии интеграции. Сайт конкретных протоколов интеграции в настоящее время разрабатываются для генов в других системах , использующих систему CRISPR-Cas ^42,43. Они будут иметь большое значение в расширении использования RAPID дополнительных систем. Другим перспективным применение RAPID для выделения РНК, которые связаны с мРНК, представляющей интерес. Это может быть легко достигнуто, подвергая Выделенное вещество к РНК-последовательность SEQ вместо LC-MS / MS. С учетом важной роли малых РНК в регуляции экспрессии мРНК, это приложение может иметь большое значение. И, наконец, улучшения в масс-спектрометрии (МС) анализ и использование количественных методов, таких как MS SILAC приведет к количественной меры мРНК-связанного Proteiнс при различных условиях. RAPID могут быть использованы с использованием дрожжей , выращенных в средах , обогащенных тяжелыми изотопами , и по сравнению с клетками , выращенных в различных условиях (например, стресс) с немеченых сред ^44,45. Применяя экспрессный метод вместе с количественным анализом МС будет давать точные измерения изменений в ПОР репертуара, которые связаны с конкретной мРНК.

The authors declare no competing financial interests.

Мы благодарим профессора Джеффа Джерст и Борис Слободин за их полезные советы по настройке Стремительное протокола и предоставления необходимых плазмид. Мы также благодарим доктора Avigail ATIR-Ланде за помощь в создании этого протокола и д-р Тамар Зива из Smoler протеомики Центра за помощь с анализом LC-MS / MS. Мы благодарим профессора Т.Г. Kinzy (Rutgers) для YEF3 антитела. Эта работа была поддержана грантом 2011013 от научного фонда бинасиональ.