Подготовка и 3D Tracking каталитических Плавательные устройств

A method to prepare catalytically active Janus colloids that can "swim" in fluids and determine their 3D trajectories is presented.

We report a method to prepare catalytically active Janus colloids that "swim" in fluids and describe how to determine their 3D motion using fluorescence microscopy. One commonly deployed method for catalytically active colloids to produce enhanced motion is via an asymmetrical distribution of catalyst. Here this is achieved by spin coating a dispersed layer of fluorescent polymeric colloids onto a flat planar substrate, and then using directional platinum vapor deposition to half coat the exposed colloid surface, making a two faced "Janus" structure. The Janus colloids are then re-suspended from the planar substrate into an aqueous solution containing hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide serves as a fuel for the platinum catalyst, which is decomposed into water and oxygen, but only on one side of the colloid. The asymmetry results in gradients that produce enhanced motion, or "swimming". A fluorescence microscope, together with a video camera is used to record the motion of individual colloids. The center of the fluorescent emission is found using image analysis to provide an x and y coordinate for each frame of the video. While keeping the microscope focal position fixed, the fluorescence emission from the colloid produces a characteristic concentric ring pattern which is subject to image analysis to determine the particles relative z position. In this way 3D trajectories for the swimming colloid are obtained, allowing swimming velocity to be accurately measured, and physical phenomena such as gravitaxis, which may bias the colloids motion to be detected.

Каталитические устройства плавания небольшие масштабы, неуправляемые коллоиды , способные автономно генерировать движение в жидкостных средах. ^1,2 Эти устройства привлекают значительное внимание исследователей , поскольку они имеют потенциал , чтобы включить новые захватывающие функции , такие как доставка лекарственных средств, ³ лаборатории на чипе транспорта ⁴ и восстановление окружающей среды. ⁵ Одним из широко изученным примером являются каталитическими "Янус" пловцов. ⁶ Эти частицы получили свое название от того , две различные стороны или лица (Янус два перед римским богом). Одна сторона вл етс каталитически активным и способен выполнять реакцию разложения, в то время как другой является инертным. В присутствии подходящих растворенных молекул топлива, в результате асимметричный химическая реакция создает градиенты вокруг коллоидов , которые могут производить движение через себя диффузиофореза / электрофорезом. ⁷

Характеризуя движение для этих быстро движущихся объектов Cha llenging и многие экспериментальные наблюдения до настоящего времени были ограничены 2D. Тем не менее, возможные приложения могут использовать стимулирующую плавательные устройства возможность перемещаться по насыпных решений в 3D. ⁸ Для решения этой проблемы , здесь мы опишем протокол , который позволяет точные 3D - траектории для плавания устройств , которые будут определены. Этот метод основан на интерпретации кольцевых структур , произведенные не в фокусе флуоресцентных коллоидов , наблюдаемых с фиксированным фокусом объектива, ⁹ и легко наносится с помощью обычных немодифицированных микроскопов. Четко описывая этот метод здесь, другие исследователи в этой области пойдет на пользу, будучи в состоянии получить доступ к такой 3D информации. Это поможет в будущем понимание характеристик движения для плавательных устройств. Свидетельством этого потенциала определяется недавнем докладе плавательных устройств направлены под действием силы тяжести, ^10,11 поведение , которое может быть наиболее легко визуализировать посредством применения 3D - слежения. ¹¹

ВНИМАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь все соответствующие паспорта безопасности материала перед использованием. Перекись водорода используется в данном протоколе является вредным, а эволюция газообразного кислорода при воздействии на платину создает опасность взрыва. Используйте все соответствующие меры контроля безопасности во время этого протокола, включая технические средства контроля при обращении растворов пероксида (вытяжной шкаф) и средства индивидуальной защиты (защитные очки, перчатки и лабораторный халат).

1. Создание каталитического Janus Частицы

1. Приготовьте стеклянную подложку слайд
   1. Очистите неиспользуемый стандартного микроскопа с использованием последовательного промывку в течение нескольких минут каждый в деионизованной (ДИ) воды, стекла обеззараживание раствором и дистиллированной воды. Затем промыть водой с 70:30 обоб смеси этанола: ДИ воды, и, наконец, высушите в потоке чистого воздуха / азота.
   2. Осмотрите предметное стекло под микроскопом, чтобы проверить, чтобы поверхность была чистой и свободной от доказательств загрязнения твердыми частицами. Повторите шаг 1.1.1, если требуется.
2. Подготовить коллоидную дисперсию для осаждения
   1. Внесите 10 мкл водного раствора коллоидного запас люминесцентная (10 мас.%) В 990 мкл этанола. Отрегулируйте объемы по мере необходимости в зависимости от концентрации исходного раствора, используемого, чтобы достигнуть примерно 0,1% мас коллоидной суспензии.
   2. Вихревой смесь в течение 10 сек.
3. Спин слой коллоидной дисперсии на подложку из стекла слайд
   1. Одета спиновый станок с чистой предметное стекло. Заполните наконечник пипетки с 100 мкл разбавленного коллоидного раствора, приготовленного выше. спин Программа для нанесения покрытий выполнить 30 сек, 2000 оборотов в минуту цикла. Запуск отжима устройства для нанесения покрытия, и, когда до скорости непрерывно пипеткой приготовленный раствор на центр центробежно предметное стекло.
   2. Удалите предметное стекло от спина нанесения покрытий, вернуться в оптический микроскоп и убедитесь, что даже дисперсия в основном не соприкасающихся отдельных коллоидов охватывает центральную область Oе на предметное стекло.
4. Вакуумная испаряются металл платиновой группы на коллоидной украшены стекло
   1. Вставьте коллоидный покрытием предметное стекло в металлический испаритель. Убедитесь, что коллоид декорированный сторона обращена к источнику испарения. Установить источник испарения платины металла и осаждают 15 нм металлической платины.
      Примечание: После осаждения металла, пробы должны храниться в инертной атмосфере.

2. "Плавательные" Янус Частицы

1. Повторное приостановить Janus коллоидов в раствор , содержащий перекись
   1. Вырезать 1 х 1 см площади линзы ткани и смочите конец с 10 мкл деионизированной воды. Удерживая пинцетом, и аккуратно протереть вдоль поверхности платины с покрытием коллоидной декорированный предметное стекло (этот шаг физически удаляет коллоиды от подложки).
   2. Вставьте ткань объектива в 1,5 мл дистиллированной воды и вручную энергично встряхивают в течение 30 секунд в герметичном Tuбыть. Удалить объектив ткани.
   3. Пипетка 1 мл коллоида , содержащего раствор в новый контейнер, заполненный 1 мл 30% вес / об H ₂ O ₂ маточного раствора. Аккуратно перемешать растворы, а затем поместить в ультразвуковой ванне при комнатной температуре в течение 5 мин, а затем еще на 25-минутного периода инкубации без перемешивания.
      ВНИМАНИЕ: Это решение может развиваться кислород; не печать.
   4. Сухие 100 мкл оставшегося водного раствора коллоидного на сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) заглушке для того, чтобы SEM проверки структуры коллоидной Janus. ¹⁴
2. Подготовить анализ кювету
   1. Добавить дополнительно 1 мл дистиллированной воды к инкубируемого раствора, содержащего перекись, и платиновые покрытием коллоиды, чтобы прийти к соответствующей прочности топлива (10%), чтобы обеспечить быстрое двигательной установки.
      Примечание: предыдущие стадии инкубации проводили в более высоких концентрациях концентрация топлива для очистки поверхности платинового катализатора.
   2. Заполните лож объем прямоугольной формы из кварцевого стекла кювету с раствором инкубированных. Неплотно соответствовать Быстроразьемное колпачок.
      ВНИМАНИЕ: Опасность взрыва - не используйте винтовую крышку.

3. Микроскопическое наблюдение

1. Найдите частицу интереса
   1. Нагрузка кювету в флуоресцентный микроскоп , снабженный подходящей цели (например, 20Х) и возбуждают излучение флуорофора с использованием подходящей комбинации фильтров (возбуждения 450-490 нм, эмиссия> 515 нм).
   2. Ручной поиск люминесцентных коллоидов внутри кювете.
      Примечание: Регулировка плотности коллоидный при поддержании концентрации пероксида может потребоваться. Например, разбавление рекомендуется, если коллоид плотность высока, и многочисленные пузырьки кислорода, продуцирующие потоки присутствуют. Концентрация Объем коллоидный около 0,003% является рекомендуемой отправной точкой.
   3. Оптимизация оптических параметров для 3D-слежения: при подходящих условиях освещения, яп фокус коллоидов будет выглядеть как острые круглые объекты. Однако, как двигательная перемещает коллоидов и из фокальной плоскости отличительный размер меняется яркое кольцо, сосредоточенный вокруг области будет наблюдаться, это используется для определения координат г, чтобы включить 3D-слежение.
2. Запись видео
   1. Перед началом захвата видео, фокус микроскопа так, что частица интерес вызывает концентрическое кольцо, с частицей "под" положением фокуса. Не двигайся фокальную плоскость во время захвата видео.
   2. Запись видео частиц, представляющих интерес. Используйте 30 сек видео продолжительность с частотой кадров превышает 30 Гц, чтобы разрешить детальную реконструкцию траектории.
3. Реконструкция 3D траектории
   1. Калибровка Z-оси
      1. Составляют 2% мас. геллановая раствор камеди в воде, содержащей суспензию флуоресцентных частиц Януса при 60 ° С, помещают в эквивалентной кювету длячто использовали выше, и позволяют установить, чтобы сформировать жесткую прозрачную гелеобразной образец, содержащий фиксированные статические коллоиды.
      2. Фокус на одной фиксированной коллоида с использованием тех же условий освещенности, выбранные выше, в настоящее время записи серии неподвижных изображений в виде Z-фокуса возбуждается известных смещений относительно этой плоскости.
      3. Определить радиус кольца на каждом известном положении фокусировки ^11.
         Примечание: Это наиболее эффективно осуществляется с использованием алгоритма анализа изображений, который может быть применен в качестве периодического процесса, чтобы все калибровки отдельных кадров, и видео. Типичный подход предполагает сглаживание изображения, пороговая, чтобы определить приблизительное местоположение центра объектов, а затем местонахождение действительных х и у координаты центра кольца путем измерения расстояния между пиками интенсивности обе стороны от кольца. Среднее радиальное расстояние до пиков интенсивности от центра кольца , то можно найти. ¹¹ Это позволяет , и радиус яркому кольцомd ху координат определяется с субпиксельной точностью. При размещении х, у, г положение сферы Януса закрепленной в геллановой камеди 30 мкм от фокальной плоскости, во временной последовательности изображений, частицы могут быть расположены с погрешностью ± 25 нм вдоль каждой оси. Ошибка может быть связано с шумом в изображениях. Соотношение сигнал-шум и, следовательно, точность определения местоположения алгоритмов зависит от интенсивности обнаруженного света флуоресценции. Когда сфера Janus находится далеко от фокальной плоскости его интенсивность становится слишком слабым , чтобы точно отслеживать его, например, для диаметра 4,8 мкм коллоидного Z-диапазон около 200 мкм возможно. Альтернативный неалгоритмические метод заключается в использовании простого ручного измерения х, у центра и радиус, однако это приводит к снижению точности.
      4. Участок калибровочной кривой , соотносить радиус г- м положении, и подходят к соответствующей функции (например, кубическое уравнение) , чтобы позволить интерполяции. ¹¹
   <литий> Калибровать х, у оси
   1. Запись статичный кадр оптического микроскопа изображение пространственной калибровки сетки с использованием тех же условий микроскопа, выбранных в 3.2.
   2. Мера "в пикселях" размер объекта с известным размером реального мира с изображением пространственной калибровки и сетки использовать эту функцию, чтобы установить пикселей на коэффициент преобразования микрона для х, у плоскости изображения.
   2. Реконструировать траекторию
      1. Определить координаты х и у и радиус для каждого кадра видеопоследовательности, как описано в 3.3.1.3, используйте функцию найденное в 3.3.1.4 для преобразования радиуса в г, а коэффициент калибровки найденный в 3.3.2.2 для преобразования х и у пиксельные координаты в микронах. Эта процедура приводит к точному х, у, г координата расположения пропульсивной частиц в виде функции от времени. ¹¹ Эта процедура может быть реализована с использованием алгоритма, или вручную.
      2. Определение производной рЕ СВОЙСТВА, такие как средняя скорость для количественной оценки степени наблюдаемого каталитического плавания.

На рисунке 1 показана типичная дисперсию коллоидов на чистую предметное стекло перед нанесением платины. На рисунке 2 показан типичный Рассеянный назад СЭМ - изображение в течение половины платины , покрытого Януса пловец, в этом режиме формирования изображения область платина покрытием позволяет получить яркий контраст. Нужный полусферический слой платины очевидно. Рисунок 3 показывает внешний вид типичного флуоресцентного Janus пловца при оптимальных условиях освещения , установленных в геллановой камеди. Пловец появляется как симметричная особенность кольца, и это радиус кольца , которое может быть использовано для определения Z-положение коллоидной по отношению к положению фокуса. На рисунке 4 показаны репрезентативные поперечные сечения для распределения интенсивности радиальной яркости, используется в сочетании с алгоритмами анализа изображений , чтобы точно определить местонахождение центра и видимый радиус коллоида. фиг.5 г> содержит калибровочной кривой, полученной с использованием фиксированного коллоидный образца и калиброванное столик микроскопа Z-перевод соотнести видимую коллоидного размера и расстояние от точки фокуса. Эта кривая крепится к кубической функции, которая используется для преобразования в видимый радиус Z-координату. И, наконец, на рисунке 6 приведен типичный х, у, г траектория для флуоресцентного Janus пловец частиц.

Рисунок 1. Оптическое изображение диаметром 1,9 мкм полистирольных микросфер. Микросферы диспергируют на очищенном стекле перед осаждением Platinum. Шкала бар составляет 40 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

эс / ftp_upload / 54247 / 54247fig2.jpg "/>
Рисунок 2. СЭМ изображение обратного рассеяния диаметром 1,9 мкм полистирольных микросфер. Микросферы показаны после осаждения платины. Шкала бар представляет собой 2 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Калибровка изображения диаметром 4,8 мкм флуоресцентного полистирола сфере фиксированной в геллановой камеди , записанной с использованием объектива 20X (0,4 NA). Расстояния ниже каждого изображения указывают расстояние от фокальной плоскости объектива выше сферы. Поскольку изображение дефокусируются от 0 мкм до 200 мкм в фокусе в образ ярких изменений диска на яркое кольцо, радиус которого зависит от увеличения, СФЕРе размер и расстояние от фокальной плоскости. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. X, Y, Z процедура отслеживания частиц. Набор алгоритмов самостоятельно написанный используется сначала найти (х, у) центр яркое кольцо, извлекая серию вертикальных и горизонтальных линий и находя среднее средне- точка между светлыми вершинами (а). Радиус кольца затем вычисляется из пиковой интенсивности сплайна , установленного на среднем пиксельных серых значений , исходящих из центра кольца (б). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5. Z-координата калибровки диаграммы для Janus сфер , полученных путем измерения яркий радиус кольца сфер , закрепленных в геллановой камеди (см 3 и 4). Калибровка график используется нашими алгоритмами для преобразования измеренного радиуса кольца к Z- координаты. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6. Траектория типичного флуоресцентного Janus сфера плавательным устройства. Последовательность изображений движущихся плавательным устройства регистрировали в течение периода 30 с при частоте кадров 33 Гц. (Х, у, г) координаты траектории были получены путем размещения яркое кольцо центр (Fi4 цифра (а)) и сравнения измеренного радиуса кольца к калибровочной диаграммы для каждого изображения в последовательности (рис 4 (б) и 5). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Многие переменные в протоколе подготовки к платиновых частиц Януса будут влиять на наблюдаемые траектории. Параметры, описанные с использованием частиц диаметром 2 мкм даст двигательные скорости порядка 10 мкм в секунду. Если используются более мелкие частицы, скорость будет увеличиваться, в то время как увеличение размера частиц будет уменьшаться скорость метания. ¹² Детали протокола испарения также изменяют траектории , наблюдаемые. В этом текущем протоколе, разреженный распределение коллоидов рекомендуется, вместе с испарением металла нормальной ориентации слайдов. Эти условия приводят к симметричных структур Янус , как показано на рисунке 2, которые приводят к линейным траекториям в пределах броуновского вращательной диффузии. ¹³ И наоборот, если плотно упакованные коллоидов подлежат поглядывая отложение угол, то симметрия крышки Janus может быть нарушена , чтобы вызвать вращение поведение. ¹⁴ в годrticles производимые здесь отображаются относительно изотропное движение во всех трех измерениях; Однако , если используются более толстые платиновые покрытия, или более крупные частицы, направленного вверх смещения или gravitaxis может быть придана. ¹¹ Подробная информация о хранении коллоидов Janus после изготовления может также влиять на скорость плавания , наблюдаемые. Высокая поверхностная энергия чистой платиновой поверхности , выходящий из стадии выпаривания подвержен загрязнению поверхности, например , из углеводородов, и , в частности , тиолов. ¹⁵

Кроме того, свойства раствора, в котором коллоиды Janus ресуспендировали являются критическими для наблюдения двигательной установки. Низкие концентрации перекиси приведет к замедлению скорости, так как скорость реакции разложения производящего движения уменьшается. ⁶ Кроме того, низкие концентрации солей приведет к резкому снижению скорости движения. ⁷

Ключевой особенностью коллоидов, производимых здесь их пеutral плавучести, что делает их пригодными для 3D-слежения. В общем поле плавательных устройств мало обращали внимания на 3D - эффекты, отчасти из - за некоторых ярких примеров того , изготовленные из плотных металлов, заставляя их быстро отстой, ¹⁶ , но и из - за трудностей и расходов , связанных с созданием необходимых измерений. Четкие недостатки для некоторых установленных методов 3D отслеживания существуют для этих быстро движущихся коллоиды, например, помощью конфокальной сканирующей лазерной микроскопии может недоставать временное разрешение для записи достаточное количество изображений для разрешения траекторий. В этом контексте, метод, который мы приводим здесь имеет значительное преимущество только требует отдельного кадра, чтобы позволить оценку г-координаты, что, следовательно, обеспечивает высокую частоту кадров. Кроме того, как реконструкция Z-координата зависит только от относительного контраста коллоида несфокусированный в отдельных кадров, а не абсолютной интенсивности флуоресценции, он устойчив к закалке и мигающие эффектыв флуорофора. Эти преимущества возможны за счет уменьшенной глубины поля, над которым реконструкция 3D траектории возможно, и требование хорошо разделенных непересекающиеся коллоидов. Мы надеемся, что описание протокола позволит другие исследовательские группы с интересом к 3D-поведения для своих плавательных устройств для доступа к этой информации и прямолинейно с высокой степенью точности. Совершенно очевидно, что расширение понимания этих устройств к 3D откроет значительный спектр интересных будущих явлений и приложений. Читатели, заинтересованные в более подробной информации о траектории анализа направлены Reference 17, который описывает общие артефакты в прямоточных системах и как обеспечить точную количественную оценку двигательных скоростей.

The authors have nothing to disclose.

This work was supported by EPSRC Career Acceleration grant EP/J002402/1.