Генома Очистка экстрахромосомального кольцевой ДНК из эукариотических клеток

This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.

Экстрахромосомального кольцевых ДНК (eccDNAs) являются общие генетические элементы в Saccharomyces CEREVISIAE и представлены в других эукариот , а также. EccDNAs способствуют генетической изменчивости среди соматических клеток в многоклеточных организмах и эволюции одноклеточных эукариот. Чувствительные методы обнаружения eccDNA необходимы, чтобы выяснить, как эти элементы влияют на стабильность генома и, как экологические и биологические факторы вызывают их образование в эукариотических клетках. Это видео представляет собой чувствительный метод eccDNA-очистки под названием Circle-Seq. Способ включает в себя очистку столбца кольцевой ДНК, удаление остаточного линейного хромосомной ДНК, прокатный круг усиление eccDNA, глубокое секвенирование и картирование. Обширное лечение экзонуклеазная было необходимо для достаточной линейной деградации хромосомной ДНК. Шаг прокатки круга амплификацииINE-высота:. нормальный; "> φ 29 - полимераза обогащенные для кольцевых ДНК по линейной ДНК Проверка Кольцевой-Seq методом на трех S.cerevisiae , CEN.PK популяций 10 ¹⁰ клеток обнаружены сотни профилей eccDNA в размерах , размер которых превышает 1 килобаза . Повторные находки ASP3-1, COS111, cup1, RSC30, HXT6, HXT7 генов на кольцевой ДНК в обоих S288c и CEN.PK предполагает , что ДНК циркуляризации сохраняется между напряжениями на этих локусов. в сумме, Круг-Seq метод имеет широкое применимость для генома масштабного скрининга на eccDNA в эукариот, а также для выявления специфических типов eccDNA.

Обнаружение ранней или переходную хромосомной амплификации трудно, поскольку она требует идентификации изменений в отдельных молекул ДНК в больших популяциях клеток. Хромосомные вариации копирования номер (ВКК) , как правило , обнаруживаются также после их создания, оставив только окончательную структуру CNV в качестве доказательства механизма , который сгенерировал вариации ^1,2. Обнаружение и восстановление экстрахромосомного кольцевую ДНК (eccDNA) в ранних стадиях формирования CNV может пролить свет происходящие процессы в геномных перестроек.

Ранее De Novo открытие eccDNA было по электронной микрофотографии ^3, Гимза окрашивания метафазных хромосом ⁴ или двухмерного электрофореза гель ^5. Эти методы дают мало или нет информации о последовательности кольцевой ДНК. Адресные методы , такие как Саузерну ^6,7, обратный PCR ^8, или флуоресценцию на месте hybridizatio вп ⁹ свидетельствуют лишь о конкретных элементах eccDNA. Ни один из этих методов не обеспечивают последовательность всех существующих типов eccDNA в клеточной популяции.

Геномная расхождение в пуле клеток можно охарактеризовать секвенирование генома и / или облицовочных массивов ^10,11. Детектирование удалений или амплификации обычными способами очистки ДНК , как правило , требует , чтобы мутировавший аллель , составляют не менее 0,1-1% от клеточной популяции ^12,13. Ацентрический eccDNAs, как ожидается, будет еще более переходная в культуре клеток из-за их отсутствия центромерах и потенциального отсутствия синтеза ДНК при репликации. Таким образом, так как большинство eccDNAs предположительно находятся в небольших количествах и их последовательности напоминают геном, альтернативные методы экстракции ДНК необходимы для обнаружения eccDNAs.

Несколько круговых методов очистки ДНК используют структурные различия между хромосомами и кольцевой ДНК. Например, высокоскоростной ultracentrifugвания в цезий-хлоридно градиентов используется для изоляции 350-3000 пар оснований (п.о.) большие eccDNAs из человеческого HeLa клеток рака линии ^14. Тем не менее, высокая скорость может привести к поломке или ник основу суперспиральных структур кольцевых ДНК, изменяя скорость ¹⁵ оседания и выход eccDNA. Датта и его коллеги разработали метод De Novo, геном масштаба идентификации кольцевых ДНК из тканей мышей, а также из культур куриных и человеческих клеток ^16,17. Их метод извлечения ядер из гомогенизированной ткани с помощью ультрацентрифугирования сахарозы с последующей очисткой плазмиды и нескольких раундов ферментативных реакций и извлечения ДНК. Их протокол в основном идентифицирует 200-400 п.о. eccDNAs, называемые microDNAs. Датта и его коллеги также пытались очистку microDNAs из Saccharomyces CEREVISIAE , но не смогли записать microDNA из этих дрожжей вида ^16.

Мы разработали новый методDe Novo обнаружение eccDNA из дрожжей под названием Circle-Seq. Этот метод позволяет геном масштабных обследований для кольцевых молекул ДНК достаточно большой, чтобы нести целые гены и как крупные, как 86 килобаза (кб) митохондриальной ДНК (мтДНК). Метод Круг-Seq был разработан с хорошо налаженной прокариотической плазмиды способа очистки ^18,19, оптимизированная для эукариотических клеток дрожжей и в сочетании с глубоким секвенирования. Используя Круг-Seq подход, 1756 различных eccDNAs, все больше 1 Кб, были обнаружены из десяти S. CEREVISIAE S288c популяций ^20. Размер отсечка был выбран, чтобы сосредоточиться на eccDNA, которые были достаточно большими, чтобы нести целые гены. Круг-Seq был очень чувствительным; он обнаружил одну eccDNA в пределах тысяч ячеек ^20. В текущем исследовании, Круг-Seq был использован для выделения и идентификации 294 eccDNAs из трех биологических повторностях другого S. CEREVISIAE штамм дрожжей, CEN.PK. Данные показывают, что eccDNA является распространенным генетическим Elemeнт в S. CEREVISIAE штаммы.

Примечание: обзор очистки круговой ДНК и методом секвенирования (Круг-Seq) показана на рисунке 1.

1. Выращивание, Cell Harvest и плазматической мембраны Срыв

1. Привить клетки дрожжей (например Saccharomyces CEREVISIAE) из O / N культуры в 50 мл полной питательной среде дрожжей пептон декстроза (YPD). Инокулируйте при низкой начальной плотности клеток 1-3 × 10 ⁵ клеток / мл или оптической плотностью приблизительно 0,01 OD _600.
   1. Инкубируйте клетки при 30 ° С при перемешивании со скоростью 150 оборотов в мин (оборотов в минуту) до тех пор , пока клетки не достигают максимальной плотности клеток приблизительно 1 × 10 ¹⁰ клеток, примерно через 24 до 48 ч , или оптическую плотность при OD _600> 10,0.
      Примечание: Время культивирования не имеет решающего значения, как можно использовать более низкие концентрации клеток.
2. Перенести переросла культуру в коническую пробирку емкостью 50 мл, в пробирке осадка клеток центрифугированием при800 мкг в течение 3 мин и отбросить супернатант.
3. Промывают осадок с 25 мл буферного раствора 10 мМ Трис-Cl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0, повторно осаждения клеток центрифугированием при 800 х г в течение 3 мин и отбросить супернатант.
4. Ресуспендируют осадок клеток в 1,2 мл ресуспендирующего буфера, подаваемого из комплекта плазмида колонного очистки.
5. Необязательный шаг: Добавьте сильно разбавленных плазмид в качестве контроля для очистки кольцевых элементов ДНК ^20.
   Примечание: В текущем наборе данных, плазмида смесь 7,7 мкл наносили для каждого образца , содержащего 10 ¹⁰ клеток. Плазмида запас смесь состояла из трех плазмид в различных концентрациях; pBR322 при 38 нг / образец, pUC19 на уровне 0,5 нг / образец, и pUG72 на 0,01 нг / образец.
6. Передачи клеточной суспензии на две 2 мл микро-центрифужные пробирки, каждая из которых дополняется 0,5 мм стеклянных шариков в соотношении 1: 3 от общего объема суспензии.
7. Vortex каждую пробирку на максимальной скорости в течение 10 мин, чтобы сорвать плазматическую клеткуМембраны. Гранул шарики центрифугированием при 268 мкг в течение 30 секунд и переносят 1,2 мл супернатанта комбинированный из двух микропробирок в новую пробирку.
   Примечание: Альтернатива к шагу 1,6-1,7, используйте zymolyase для разрушения клеток в 0,6 мл ресуспендирования буферного раствора. Десять единиц zymolyase может нарушить 5 х 10 ⁷ клеток в течение 1,5 ч при 35 ° С.

2. EccDNA Обогащение с помощью колоночной хроматографии

1. Следовать протоколу из набора для очистки на колонке с плазмид. Короче говоря, рассматривать каждую пробу с 1,2 мл щелочного раствора, аккуратно перемешать и инкубировать в течение 3 мин при комнатной температуре.
2. Добавьте 1,2 мл нейтрализующего буфера, аккуратно и центрифуга смешать в 9650 мкг в течение 5 мин.
3. Загрузка раствора на колонку, уравновешенную с 1 мл раствора для уравновешивания и позволяет жидкости протекать через колонку под действием силы тяжести.
4. Промывают колонку моющего раствора 4 мл. Когда раствор проходит через смолу, осторожно добавляют 0,3 мл элюирование таклюция заменить большую часть 0,35 мл колонку объемом пустот.
5. Элюции ДНК в новую пробирку для сбора с 1 мл элюирующего раствора и осаждения ДНК добавлением 0,8 мл преципитации смеси. Центрифуга при 9650 мкг в течение 10 мин.
6. Вымойте ДНК гранул с 0,5 мл 70% этанола, центрифуге при 9650 мкг в течение 5 мин, воздух сухой в течение от 5 до 15 мин и растворить очищенную ДНК в 25 мкл стерильной воды.
   Примечание: Только кратковременного хранения ДНК в воде рекомендуется. Предпочтительно, переходите к шагу 3.

3. Расщепление Оставаясь линейной хромосомной ДНК

1. Необязательный шаг: Для облегчения конкретного переваривание линейной ДНК с помощью экзонуклеазы, обработайте очищенную ДНК с редкой режущим эндонуклеазы, такие как NotI. Для получения 5 мкг ДНК, используют 1 единицу NotI, 5 мкл 10х буфера пищеварения и стерильную воду до общего объема 50 мкл. Инкубируют реакционную смесь при температуре 37 ° С в течение 16 ч и тепла инактивировать эндонуклеазы при 80 ° С в течение 5 мин.
2. Добавить 20единиц экзонуклеазы (2 мкл), 4 мкл АТФ (25 мМ), 34 мкл стерильной воды и 10 мкл 10х реакционного буфера непосредственно к эндонуклеазы расщепленный ДНК в 50 мкл достичь 1х реакционного объема 100 мкл, с использованием АТФ-зависимый экзонуклеазы Комплект.
3. Выполнить гидролиз линейной одноцепочечной и двухцепочечной ДНК при 37 ° С в течение 5 дней и более. Добавление дополнительного 4 мкл АТФ (25 мМ), 0,6 мкл 10х реакционного буфера и 20 единиц экзонуклеазы каждые 24 ч, чтобы продолжить ферментативное переваривание ДНК при 1х реакционного объема.
4. После удаления линейной ДНК, образец 2 мкл из экзонуклеазной обработанному раствору , чтобы подтвердить устранение хромосомной линейной ДНК с помощью количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР), с использованием хромосомной маркер , такой как ген актина ACT1 ^20.
   1. Каждый 20 мкл КПЦР объем реакционной смеси содержит 2 мкл экзонуклеазы обработанного образца, 150 нм ACT1 праймеров 5'-TCCGTCTGGATTGGTGGTTCTA-3 'и 5'-TGGACCACTTTCGTCGTATTC-3 ', 2% (объем / объем) диметилсульфоксида, и 10 мкл зеленого флуоресцентного основной смеси.
   2. Использование условий реакции; 3 мин при 95 ° С, а затем 45 циклов 15 с при 95 ° С и 30 с при 60 ° С.
      Примечание: СИГН1 является особенно подходящим маркером для линейной ДНК , поскольку вариации номер копии этого гена являются пагубное ^21-23 так eccDNA не должны нести ACT1.
   3. Альтернативы анализу переваривания ДНК с помощью кПЦР являются стандартной ПЦР (4.3) или пропидийиодидом окрашивание (4.4).
      1. Используйте 2 мкл экзонуклеазы обработанного образца в качестве матрицы для ПЦР с СИГН.1 праймеров 5'-TGGATTCTGGTATGTTCTAGC-3 'и 5'-GAACGACGTGAGTAACACC-3'. В качестве положительного контроля СИГН.1, используют 50-100 нг геномной S. CEREVISIAE ДНК в качестве матрицы. Условия реакции ПЦР; 3 мин при 95 ° С, с последующими 35 циклами 30 сек при 95 ° С, 30 сек при 56 ° С и 1 мин при 72 ° С.
      2. Запуск реакции ПЦР с помощью гель electrophoreСИС на 1% агарозном геле с 0,5 мкг / мл этидий-бромида. Посмотрите на 0,8 кб СИГН.1 полосы.
   4. Отсутствие или наличие линейной ДНК также могут быть исследованы с помощью пропидиума йодида окрашивания до и после амплификации ДНК.
      1. Смешайте каждый образец ДНК в 1: 1 объем с 1: 1000 H ₂ O-разбавленного раствора 20 мМ пропидийиодидом запаса. Оставьте раствор в темноте в течение 10-20 мин при комнатной температуре и анализируют окрашиванием ДНК с помощью флуоресцентной микроскопии при 100-кратном увеличении с использованием красной флуоресценции фильтра возбуждения при 663-738 нм и экспозиционной времени от 5 до 30 сек. В качестве контроля ДНК-окрашивание, использование ø29-амплифицируют геномную ДНК из дрожжей и / или ø29-амплифицировали плазмиды.
5. Тепло инактивировать раствор экзонуклеазной при 70 ° С в течение 30 мин.

4. амплификацию ДНК

1. Amplify очищенный и обогащается eccDNA со стадии 3.5) с помощью ДНК - полимеразы ø29 ^24-26 ACCORDИнг к протоколу производителя полимеразы.
   1. Короче говоря, смешайте 5 мкл, обогащенные eccDNA с 5 мкл буфера для денатурации.
   2. Через 3 мин при комнатной температуре, добавляют 10 мкл буфера для нейтрализации. Осторожно перемешать и добавить 30 мкл основной смеси, содержащей 29 мкл реакционного буфера и 1 мкл ДНК-полимеразы ø29. Инкубируют реакционную смесь при температуре 30 ° C в течение 16 часов или более (до 72 ч). Тепло инактивировать ø29 ДНК-полимеразы при 65 ° С в течение 3 мин.

5. Секвенирование и анализ данных

1. Сдвигать усиленную eccDNA сфокусированным ультразвукового дезинтегратора до среднего размера целевого пика в 300 пар оснований. Используйте следующие параметры для 130 мкл образца ДНК: мощность 450W пиковой интенсивности, 60 сек лечения, 30% коэффициент заполнения, 200 циклов в порыве, температура 7 ° C.
2. Добавить штрих-код этикетки и индексные адаптеры к фрагментированным читает для синтеза библиотек для секвенирования, используя соответствующий метод для подготовки библиотеки.
3. Глубоки последовательности, например, как 141-нуклеотид одного конца читает на секвенирования платформы с высокой пропускной способностью.
4. Карта читает к опорному генома дрожжей исследуемой и позволяют читает карту к нескольким регионам. Например, можно использовать свободно доступную систему ^27,28 документооборота и короткого чтения картографическое программное обеспечение Согласователь ^29.
5. Идентифицировать читает из регионов предполагаемыми eccDNAs использованием , смежный чтений, например, более семи смежных операций чтения (> 1 кб) без пробелов ^20.
   Примечание: Программное обеспечение доступно для изучения ^27,28 сопоставляются читает в геномных областях , представляющих интерес.

Для проверки метода Circle-Seq, три S. CEREVISIAE CEN.PK популяции 1 × 10 ¹⁰ клеток подвергали скринингу после того, как клетки выращивали отдельно в YPD в течение десяти поколений. Устранение линейной хромосомной ДНК , было подтверждено отсутствие сигнала КПЦР СИГН.1 , как описано выше ²⁰ (данные не показаны). Очищенная и обогащенная eccDNA секвенировали до 68 миллионов просмотров (141-нуклеотид одного конца читает) и сопоставляется с CEN.PK113-7D референсный геном (версии 19 июня 2012 года). Записи предполагаемых eccDNAs из трех образцов, названных C1, C2 и C4 были назначены геномных областей, отображенных сближенными читает больше, чем 1 кб. На основе 10000 моделирования методом Монте-Карло, значимость каждого региона отображенной сближенными читает больше, чем 1 кб была оценена. Исходя из этого 79, 159 и 56 регионов были аннотированный , как вероятные последовательности eccDNA (р <0,1, Dataset 1). Число зарегистрированных contiguoмы читает> 1 кб увеличивается в зависимости от глубины последовательности предполагая , что еще больше eccDNA элементы были бы записаны , если образцы были секвенированы Далее (рисунок 2). Как и ожидалось, метод Круг-Seq извлеченный многочисленные считывает данные из множества известных элементов, кольцевых ДНК, включая плазмиды 2 мкм, митохондриальной ДНК, рибосомных РНК-генов на хромосоме XII, и трех плазмид внутреннего контроля, pBR322, pUC19 и pUG72, которые вносили в образцы непосредственно перед очисткой на колонке (рисунок 3).

Видео показывает пример прилегающего читает , что отображается на локус HXT7 _ARS432_ HXT6 на хромосоме IV. Ранее [HXT6 / 7 ^круг] был обнаружен Круг-Seq в десяти популяциях S288c (каждый с 1 × 10 ¹⁰ клеток) и структуры круговой ДНК была подтверждена путем обратного ПЦР - анализа ^20. [HXT6 / 7 ^CIrcle] также был записан в каждой из трех популяций CEN.PK (рис 4A). Кроме того, большинство общих генов eccDNA среди дублирующих образцов CEN.PK перекрывается генов eccDNA из наборов данных S288c (рис 4б).

Для проверки специфичности Circle-Seq протокола для очистки кольцевых ДНК, двух образцов, каждый из которых с 30 мкг геномной ДНК, были протестированы. Один образец был дополнен 100 нг ДНК плазмиды и eccDNA из обоих образцов были очищены Круга-Seq протокола. После колоночной хроматографии, выход ДНК, составила 1,27% (380 нг) для образца без плазмиды (GD) и 1,60% (480 нг) для образца с плазмидой (GD + P). Эффективность лечения экзонуклеазной тестировали на линейном содержание ДНК через 29 ч и 72 ч с помощью ПЦР против ACT1. Ни один из образцов не содержал усиленный СИГН1 (данные не показаны). Фракцию каждого экзонуклеазной обработанного образца было далее, аmplified по ø29 полимераза и продукты ферментативных реакций анализировали с помощью пропидийиодидом окрашивания (рис 5A-F) и электрофореза в агарозном геле (рис 5г). Образцы после обработки экзонуклеазной показали минимальный пропидий йод-пятно (рис 5A-B). Ø29 - усиленный образец только с геномной ДНК показал нитевидные структуры (рис 5в) , аналогичные контрольным образцом (рис 5E). Ø29 - усиленный образец , который был добавлен плазмиды показал фокусы (рис 5D) , напоминающих управления плазмиды (рис 5F). Изображения показали, что ø29 полимеразной обогащенные для кольцевых ДНК по линейной ДНК. Наиболее линейная хромосомная ДНК была удалена из образцов после обработки 29 ч экзонуклеазной (рис 5A-B, G). Однако интенсивное лечение экзонуклеазная в течение более 100 часов и с использованием более 100 единиц было нужно , чтобы удалить все хромосомные линейную ДНК, в качестве ø29 - амплифицированный образцы все еще ​​показали фоне нитевидных структур после 72 ч обработки экзонуклеазной (Рисунок 5C-D).

. Рисунок 1. Схема круга-Seq метода Протокол состоит из 5 этапов: 1) культивирования клеток, 2) очистка и обогащение eccDNA путем колоночной хроматографии, 3) переваривания оставшиеся линейной хромосомной ДНК в элюате фракции, 4) амплификации ДНК с помощью ДНК - полимеразы ø29 и 5) секвенирования высокообогащенного eccDNA и картографирования читает на S. CEREVISIAE референсный геном. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

p_upload / 54239 / 54239fig2.jpg "/>
Рисунок 2. прилежащей читает> 1 кб в зависимости от глубины последовательности. EccDNA от 1 × 10 ¹⁰ клеток увеличиваться в зависимости от глубины последовательности (в миллионах) сопоставляется читает. Показаны: биологические утраивает от гаплоидного CEN.PK S. CEREVISIAE популяции (C1, C2, C4) , разделенных 10 ¹⁰ клеточных делений. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Обнаружение известных элементов кольцевых ДНК. (AB) Разброс участков покрытия чтения (читай плотности) в процентах для плазмид в CEN.PK биологических повторяет C1, C2 и C4. (A) Подключенные читает к эндогенным дрожжевых плазмид: 2 мкм; [РДНК ^круг] (рибосомальной РНК генов из хромосомы XII); и мтДНК (митохондриальная ДНК). (В) Уникальный чтениями для управления плазмид. Контрольные плазмиды вносили в образцы перед очисткой колонки. Плазмида отношения на клетку были: pBR322 (плюс знаки) 1: 1, pUC19 (кружки) 1:50, и pUG72 (треугольники) 1: 2500.

Рисунок 4. Элементы Общие eccDNA в CEN.PK и S288c. (A) диаграмма Венна отображения перекрытия между 476 гены на 294 eccDNA элементов в трех образцах CEN.PK (C1, C2, C4). В 16 общих перекрывающихся генов eccDNA / плазмид аннотируются (все названия генов находятся в Dataset 1). (B) , диаграмма Венна всех записанных генов на мнимых eccDNAs из трех образцов CEN.PK (C1, C2, C4), по сравнению со всеми записанными генов на мнимых eccDNAs от 10 S288c образцов: S1-S2, R1-R4, Z1-Z4 (см ссылку ^20). Показаны 13 биологических повторностей (S1-S2, R1-R4, Z1-Z4, С1-С3) с генами / плазмид и предполагаемых областей eccDNA, что перекрывается минимум 2 штамма фонов и 3 или более экспериментальных установок. Образцы C, CEN.PK; R и Z образцы, S288c BY4741; S образцы, S288c M3750. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5. Визуализация образцов ДНК после того, как экзонуклеазы и O 2 9 лечение. (AF) Пропидиум йодида окрашивание ДНК. Шкала бар, 10 мкм. (А, С и Е) Образцы с геномной ДНК (GD); (В и D) образцы с GD плюс плазмиды (GD + P). ( Онг> AB) После 29 ч лечения экзонуклеазной (EXO 29 ч); (CD) после обработки экзонуклеазной 72 часа с последующим ø29 полимеразной амплификации (EXO 72 ч + ø29). (E) геномная ДНК после того, как управление е: ø29 полимеразной амплификации; (F) контроль плазмида (5,5 кб) после того, как 29 полимеразной амплификации; (G ø) агарозный гель-eletrophoresis. Слева направо: L, 1 кб маркеров; P, контроль плазмида (5,5 кб) после EXO 29 ч; GD, после того, как EXO 29 ч (образец , как и в A); GD + P, после того, как EXO 29 ч (образец как B); GD и GD + P, после того, как EXO 29 ч + ø29; GD и GD + P, после того, как EXO 72 ч + ø29 (образец , как в CD). Смотрите таблицу S1 для дополнительных деталей. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Асет 1 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54239 / 54239dataset1.jpg "/>
1. Потенциальные набора данных участков ДНК в CEN.PK. рассылке Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.
Показаны данные о последовательности и анализ для 348 регионов. Столбцы AD, отображение eccDNA. A (первая колонка слева), образец, из которого был выявлен предполагаемый eccDNA; B, хромосомы; CD, начальный и конечный координаты предполагаемых eccDNAs. EH, содержание eccDNA. Е, автономно реплицироваться последовательность (ARS) в регионе; F, полный ген в регионе; G, часть гена, включенного в регионе; H, BLASTN идентифицированного гена. IO, охват EccDNA и р-значения. Я, самый длинный край с уникальной аннотированный последовательности в Вр; J, число всех сопоставляются читает; K, охват всех сопоставляются читает фрагментами в кб из миллиона отображенной читает (FPKM); L, р-значение для мнимого eccDNA по сравнению с возникновением случайно из Монте-Карло; М, число ипiquely сопоставляются читает; НЕТ; а K и L, используя только однозначно сопоставляются читает (UFPKM). Параметры для отображения операций чтения и моделирование по методу Монте - Карло , как описано ^20.

Круг-Seq метод позволяет генома масштабе обнаружение eccDNA из дрожжевых клеток с разрешением на уровне последовательности. Этот метод является легкой очистки eccDNA, который не требует интенсивного завихрения или пипетирования и использует разделение колонки под действием силы тяжести, чтобы ограничить eccDNA поломки, что приведет к экзонуклеазной пищеварения на последующей стадии. Эти признаки способа могут иметь решающее значение для обнаружения крупных eccDNAs, содержащих последовательности генов. Круг-Seq обнаружены многочисленные eccDNAs включая полные генов (Dataset 1). Он также обнаружил 86 т.п.н. дрожжевой митохондриальной ДНК. Таким образом, этот протокол облегчает очистку больших элементов кольцевых ДНК. Сохранение количества стадий экстракции ДНК к минимуму снижает риск потери eccDNA и максимизирует доходность. На основе результатов контроля, подскочили в плазмид, Круг-Seq обладает высокой чувствительностью, выявляя одну кольцевую ДНК из 2500 клеток. Кроме того, удаление обильные эндогенные плазмид, такие как 2 мкм; плазмида или митохондриальной ДНК может значительно повысить чувствительность. Отверждение 2 мкм от дрожжевых культур было описано ^30. В качестве альтернативы, 2μ и митохондриальной ДНК удаление могло бы быть достигнуто с редкой режущим эндонуклеазы, такой как SwaI. Тем не менее, шаг рестриктазы могут быть ориентированы на другие eccDNAs интересов и ограничить общий выход eccDNA.

Критические шаги для обнаружения eccDNA были удаление линейной ДНК (шаг 3) и секвенирования ДНК (этап 5) на нужную глубину. Для того, чтобы записать большинство eccDNAs из клеточной популяции, глубокое секвенирование может потребоваться ^20. Парноконцевое секвенирование должен обеспечить еще большую уверенность обнаружения eccDNA, как и круговые перекрестки ДНК ожидается выход парноконцевое читает эту карту вразнобой. Эти расхождения поддерживают обнаружение кольцевых структур ДНК и потенциально могут быть использованы в качестве дополнительного фильтра eccDNA обнаружения.

Круг-Seд метод был проверен путем использования трех независимых S. популяции CEREVISIAE CEN.PK. Обнаруженные последовательности включенных ранее сообщалось eccDNAs, эндогенные плазмид и шипами в плазмид и сотни предполагаемых eccDNAs (Dataset 1). Эти данные подтверждают предыдущие Круг-Seq наборов данных из S. CEREVISIAE S288c ^20. Открытие нескольких eccDNAs общих для населения CEN.PK и S288c указывает на то, что эти локусы имеют склонность существовать в виде круговых элементов (рисунок 4). Ранее мы показали , что [GAP1 ^круг] обогащен в атмосфере азота в ограниченных условиях в CEN.PK фоне ^8, хотя доказательство [GAP1 ^круга] в других слоев штамма не было найдено. Нахождение eccDNA от CUP1-1 RSC30, ASP3-1, COS111 и HXT6 HXT7 локусов в обоих S288c и CEN.PK предполагает , что предрасположенность к циклизации ДНК является конподается между штаммами дрожжей. Остается показать , если [HXT6 / 7 ^круг], [ASP3-1 ^круг], [COS111 ^круг], и [CUP1-1 RSC30 ^круг] придают селективные преимущества клеток или если их существование является лишь следствием высоких темпов ДНК циркуляризации.

Взятые вместе, результаты указывают на то, что круг-Seq хорошо подходит для обнаружения килобаза размера eccDNAs и имеет преимущества для идентификации eccDNAs с полными генов. Круг-Seq является очень чувствительным методом, который позволяет целого генома масштаба экраны eccDNAs из дрожжей. Круг-Seq метод может открыть новое направление исследований, направленных на выяснение роли eccDNA в формировании гена делеции и уточнениями. Учитывая, что архитектура и структура ДНК в значительной степени законсервирован от дрожжей до эукариотической высших эукариот, Круг-Seq метод должен, в принципе, быть applicablе для всех эукариотических клеток, с незначительными изменениями. В настоящее время этот метод не содержит каких-либо ограничений, хотя его способность очищать Мегабазе размера eccDNAs еще предстоит доказать. Кроме того, использование ø29 ДНК - полимеразы, который использует способ амплификации прокатка круга ^31, создает уклон в сторону меньших eccDNAs делая eccDNA Количественное более трудным. Круг-Seq обнаруживает eccDNAs достаточно большой, чтобы нести полные гены, что делает его пригодным для проведения исследований по двойному минут кольцевой ДНК из соматических клеток человека. Двойные минут могут способствовать к раку , когда протоонкогены усиливаются на этих элементах ^32-37. Исследования eccDNAs в клетках зародышевой линии могут быть использованы для измерения частоты мутаций зародышевой линии и оценки качества спермы, например, в животноводстве. Таким образом, Круг-Seq имеет потенциал, чтобы уступить понимание скорости, при которой возникает генетическая изменчивость в виде вариации числа копий, и привести к новому пониманию заболеваний, которые включают ген от копированияИзменение числа ^38-40.

The authors declare that they have no competing financial interests.

Thanks to Kenn D. Møller and Claus Sternberg (DTU) for technical assistance and to Tue S. Jørgensen for quantitative PCR analysis.