Monoiodoacetate модель остеоартрита боли у мышей

Остеоартроз (ОА) или дегенеративное заболевание суставов, является изнурительных состояние, связанное с болью, которая остается лишь частично контролируется имеющимися анальгетиков. Животные модели разрабатываются, чтобы улучшить наше понимание механизмов боли ОА связанных. Здесь мы опишем методологию monoiodoacetate модели ОА боли у мышей.

Основным симптомом у пациентов с остеоартритом (ОА) является боль, которая вызвана периферийным, а также изменений в центральных болевых путей. Современные методы лечения ОА боли, такие как НПВС или опиаты не являются ни эффективными, ни достаточно лишена вредных побочных эффектов. Модели на животных ОА разрабатываются, чтобы улучшить наше понимание механизмов боли ОА связанных и определить новые фармакологические мишени для терапии. В настоящее время доступны модели ОА у грызунов включают в себя хирургические и химические вмешательства в один коленного сустава. Monoiodoacetate модель (МВД) стала стандартом для моделирования совместного нарушения при ОА у крыс и мышей. Модель, которая легче выполнить в крысе, включает в себя инъекцию MIA в коленный сустав, что вызывает быстрое болевые реакции, подобные в ипсилатеральной конечности, уровень которых можно регулировать с помощью инъекции различных доз. инъекция Интраартикулярное МВД срывает хондроцитов гликолиз путем ингибирования glycerальдегид-3-фосфатазы дегидрогеназы и приводит к смерти хондроцитов, неоваскуляризации, субхондральной кости некроза и коллапс, а также воспаление. Морфологические изменения суставного хряща и кости нарушения являются отражением некоторых аспектов патологии пациента. Наряду с повреждения суставов, индуцирует инъекционные МВД называют механическую чувствительность в ипсилатеральной задней лапы и вес несущих дефицита, измеримых и количественной оценке. Эти поведенческие изменения напоминают некоторые из симптомов, о которых сообщили популяции пациентов, тем самым проверки инъекции МВД в колене в качестве полезной и актуальной доклинической модели ОА боли.

Цель данной статьи состоит в том, чтобы описать методологию внутрисуставных инъекций МВД и поведенческими записи соответствующего развития повышенной чувствительности с ума, чтобы выделить необходимые шаги, чтобы дать последовательные и надежные записи.

Клинически, остеоартроз (ОА) или дегенеративное заболевание суставов, является болезненным и изнурительным состоянием, которое характеризуется прогрессирующей потерей суставного хряща, легкое воспаление тканей в и вокруг суставов, а иногда и образованием остеофитов и костных кист. У пациентов с ОА сообщают постоянные боли ¹ и дисплей повышенной чувствительности к давлению и вредные стимулы в артритической совместного ^2-4. В настоящее время не существует никакого лечения ОА с имеющимися терапевтические подходы и анальгетики назначают для облегчения боли , связанные с этим условием, с некоторой степенью успеха ^5. Тем не менее, ОА боль остается клинической модели выпуска и животных ОА разрабатываются, чтобы улучшить наше понимание механизмов боли ОА связанных и раскрывают новые мишени для терапии.

Есть несколько моделей на животных ОА доступны с различными характеристиками ^6. Хирургические методы, такие как переднийкрестовидная рассечение, могут быть использованы. Тем не менее, они включают умелого хирургическое вмешательство и в основном выполнены на крысах, в то время как дестабилизация медиального мениска (DMM) используется в мыши. Спонтанное развитие ОА происходит в морской свинки и спонтанное дегенерации сустава сообщается в С57 черном мышей от 3 ​​-х до 16 - месячного возраста ^7,8. Спонтанные модели ОА не предполагают какого - либо вмешательства , чтобы вызвать состояние, но они имеют присущую изменчивость, и , как таковые, несут большее количество и стоимость ^9,10. Химически индуцируемые модели, с другой стороны, требует гораздо менее инвазивных процедур, чем хирургических моделей, и, как таковые, легче реализовать и позволяют изучать OA повреждений на разных этапах. Эти модели включают в себя единичные инъекции в колене воспалительных агентов, иммуно токсины, коллагеназы, папаин или monoiodoacetate, которые могут быть токсичными, если они покидают пространство сустава. Из всех химических моделей ОА, МВД является одним из наиболее часто используется, раrticularly , чтобы проверить эффективность фармакологических средств для лечения боли, так как эта модель генерирует воспроизводимый, надежный и быстрый боли, как фенотип , который может быть дифференцированный путем изменения МИА дозировки ^11-15.

инъекции Интраартикулярное МВД у грызунов воспроизводит ОА-подобных поражений и функциональных нарушений, которые могут быть проанализированы и количественно. МВД является ингибитором глицеральдегид-3-фосфатазы, разрушая клеточную гликолиза и в конечном итоге приводит к гибели клеток ^16,17. Инъекции Интраартикулярное МВД вызывает гибель хондроцитов клеток, что приводит к дегенерации хряща и субхондральной кости последующих изменений , таких как внешний вид кости остеофитов ^18,19.

По мере того как полезность МВД на крысах было описано ранее ^20, в данной работе мы ориентируемся на методологии MIA-индуцированной ОА у мышей , так как это модель все чаще используется при наличии нокаут-мышей. Мы описываем процедуру INJECние очень малых объемах в колено и методы для измерения чувствительности к вредным и безвредные раздражители в задних конечностей.

Разбивка методологии будет способствовать снижению изменчивости, и, как таковые, уточнить модель и уменьшить количество животных, необходимых для изучения.

Процедуры с участием субъектов животных были одобрены Комитетом по этике при Королевском колледже Лондона путем и в соответствии с МВД Великобритании Положения (Животные Научные Процедуры Закон 1986 г.).

1. Интраартикулярное инъекция Monoiodoacetate в колене

1. Дом 8 - 10 . Недельных мышей в группах по 5 под 12 ч цикле свет / темнота ( включение света в 7:00 утра) с пищей и водой вволю Пусть мышей акклиматизации в течение 1 недели до начала эксперимента.
2. Перемешайте и клетки мышей в группах 5. Использование числа животных как коды для слепых экспериментатору лечения. Использование веса тела в качестве параметров для рандомизации.
3. В день инъекции, свеже приготовления раствора monoiodoacetate в стерильном солевом растворе (0,9% NaCl) в требуемой концентрации. Использование стерильного физиологического раствора для инъекций в отдельной группе контрольных мышей. Самая высокая доза рекомендуется МВД составляет 1 мг в 10 мкл.
   Внимание: Monoiodoacetate является веру токсичны. Поэтому рекомендуется, чтобы перчатки и маски изношены при обращении порошка и приготовления раствора. Раствор должен быть стерильно фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм.
4. Обезболить мышей с помощью обезболивающий тележки, предварительно поместив их в камеру , поставляя 2% изофлуран в смеси O ₂ (скорость потока 1,5 л / мин) , а затем передать мышей в носовой части конуса, который также обеспечивает смесь на 2% изофлуран-O ₂ , и как таковой, поддерживает анестезии во время инъекции. Поместите ветеринарную мазь на глаза, чтобы избежать их высыхания под наркозом. Носите хирургические платье, перчатки и маску во время выполнения процедуры инъекции.
5. Подтверждение анестезии, проверяя отсутствие животного ответа на пинч раздражителя на задних лапах.
6. После того, как животное находится под наркозом, поместите его на спину. Обрезка и протирать область вокруг коленного сустава с алкоголем. Повидон-йод или хлоргексидин могут быть использованы, а также Fили дезинфекции. Связки надколенника (белая линия ниже коленной чашечки) станут видимыми.
7. Для того чтобы стабилизировать участок инъекции, держать колено до сих пор, в согнутом положении, поместив указательный палец под коленным суставом и большого пальца выше передней поверхности голеностопного сустава. Совместное предпочтение не требуется.
8. Чтобы найти точное место инъекции, запустить 26 G иглу, присоединенную к шприцу горизонтально вдоль колена (так, чтобы не проколоть кожу кончиком) до тех пор, пока не найдет разрыв под коленной чашечки. Применить мягкое давление, чтобы отметить зону, а затем поднимите иглу и шприц вертикально для инъекций. Вставьте иглу в отмеченной области, через надколенника, перпендикулярно к большеберцовой кости. Ни один сопротивление не должно ощущаться.
   1. Используйте палец в качестве руководства и придать поверхностный к месту входа. После инъекции, массаж коленного сустава, чтобы обеспечить равномерное распределение раствора. Выбросьте иглу сразу в резкомs бен.
   2. Поместите мышей обратно в чистую клетку дома на обогреваемой мат и дать им возможность восстановиться. Держите постоянную бдительность на животных, пока они не вернуть себе подходящее сознание, которое измеряется ими приходя в грудины лежачее. После того, как животные восстанавливаются, возвращаются в клетку.
      Примечание: Предлагается в целях наилучшей практики и обучения, которая используется краситель и немедленное Посмертное вскрытие, выполненного для подтверждения правильности локализации инъекции.

2. Измерение механической гиперчувствительность (аллодиния)

Примечание: Статические механические пороги абстиненции оцениваются с применением волосков фон Фрея на подошвенную поверхность задней лапы.

1. Доведите мышей к поведенческому комнате, и пусть необузданные животные акклиматизацию в акриловых кабинами (8 см х 5 см х 10 см) на вершине сетки из проволочной сетки.
   1. Поезд мышей по обработке и 2 ч приучения к кабинок в течение двух дней перед нанесением волос фон Фрея с цельючтобы ограничить стресс и ходьбу во время нанесения волосков фон Фрея. На тестовых дней, приучить животных к кабинок до 60 мин перед тестированием. Носите халаты, перчатки, маски и во всех поведенческих экспериментов.
2. Применить калиброванных волосков фон Фрея (гибкие нейлоновые волокна увеличением диаметра, которые оказывают определенные уровни силы как откалиброван производственной компании и выражается в граммах (г)) к подошвенной поверхности задней лапы до изгибах волокна. во время тестирования Используйте 0,008, 0,02, 0,04, 0,07, 0,16, 0,4, 0,6, и 1,0 г волокон.
   1. Держите каждый волос на месте в течение 3 секунд или до тех пор пока лапка не будет снята, последний определяющий положительный ответ. Начиная с силой стимула 0,07 г, применить волосы в соответствии с "вверх-вниз" метод ^21: знак в качестве X ответ вывода и O отсутствие ответа. Применение в порядке возрастания силы, до 1 г (отсечка сила), пока ответ не будет обнаружен.
   2. Повторно проверить лапу, повторяяшаг 2.2.1, начиная с нити накала, которая прикладывает усилие ниже той, которая производится вывод.
   3. Затем нанесите оставшиеся нити последовательно, по нисходящей силы, пока не происходит вывода. Повторно применять нити в порядке возрастания, пока не наблюдается ответ. Продолжайте , пока последовательность шести ответов не будет получен (например, OXOXOX), для того , чтобы получить значение 'K', ссылаясь на табличных значений ^21.
   4. Экспресс значения абстиненции лапа 50% порогов снятия лапой в граммах. Используйте формулу (10 ^{[ХГ + K б])} / 10000 , где Хг = значение последнего фон Фрея нити , используемой в последовательности (в логарифмических единиц), к = табличное значение, и δ = средняя разность сил между волокнами. Если ответ не обнаружен, используйте максимальный отклик 1 г ^21,22.
3. Следуя процедуре, описанной выше (2.2.1-2.2.4), оценивают механические пороги обеих задних лап перед тем МИА injectioп в качестве базовых значений. После инъекции, оценки порогов ипсилатеральных и контралатеральной лапы через регулярные промежутки времени в день в течение нескольких недель после МВД, чтобы выяснить, развитие механической аллодинии.
   Примечание: Например, мы сообщаем пороговые значения, измеренные 0, 3, 5, 7, 10, 14, 21, и через 28 дней после инъекции MIA. Животные считаются allodynic, когда они показывают реакцию на 0,1 г или менее. Нормальные реакции находятся в пределах 0,6 - 1 г диапазона.

3. Измерение веса подшипника дефицита

Примечание: Изменения в весе подшипников измеряют с использованием веса incapacitance тестера.

1. Поезд каждую мышь, чтобы ходить в камеру из плексигласа на аппарат и сидеть в коробке холдинга. Поместите мышь в передней части коробки холдинга, поднимите вход до 45 °, и позволяют мыши ходить и закрыть окно. Дайте животным свободно двигаться, пока они не принять сидячее положение. Это обучение занимает не менее двух дней и гарантирует, что животное еще и не лeaning по обе стороны камеры. Калибровка прибора перед использованием с 100 г контрольного веса на (или в соответствии с инструкцией оборудования).
   1. Убедитесь , что каждый заднюю лапу помещают на соответствующую площадку ¹¹ для записи. Продолжительность каждого измерения занимает 1 сек, в соответствии с инструкциями изготовителя.
2. Соберите три измерения веса несет на каждой задней лапы от площадки записи для каждой сессии записи и использовать среднее значение для вычисления разницы в весе, лежащее на ипсилатеральных и контралатеральной лапы. Экспресс значения, так как разница между контралатеральной и ипсилатеральной лапами в граммах.
3. Оценка веса подшипника изменения перед MIA инъекции в качестве исходных значений. Затем оценки повторяться через регулярные интервалы в течение нескольких недель, чтобы установить развитие изменений ворот. Например, мы сообщаем пороговые значения, измеренные на 0, 3, 5, 7, 10, 14, 21, и через 28 дней после инъекции MIA.
   Примечание: нормальный вес бколошения значение 50% представляет собой равномерное распределение веса по всей ипсилатеральной и контралатеральной задних конечностей. Животные считаются гиперчувствительной дисплей вес подшипника изменение примерно на 45%. Измерения механических порогов и отношение веса дефициты могут быть выполнены в тех же мышей, так как ни конечная точка влияет на другое. Для фармакологической оценки, каждая группа животных должны быть испытаны в установленное время после введения дозы в соответствии с фармакокинетическим профилем используемого соединения.

Недавно мы сообщали , что введение 0,5 - 1 мг МВД в мышь коленного сустава индуцирует называют механическую гиперчувствительность (аллодиния) в ипсилатеральной задней лапы и вес подшипника дефицита до 4 -х недель, хотя натисков зависит от дозы ^23.

Данные , представленные на рисунке 1 , представляют собой пример временного хода МИА-индуцированной механической гиперчувствительность в ипсилатеральной задних лап следующий диапазон доз , вводимых в колене. В частности, самая низкая доза MIA (0,5 мг / мышь), индуцированный 50% меньше, порогов по сравнению с введением физиологического раствора на 10-й день, и пороги снизилась до 70% тех, засоленных контроля на 28-й день после инъекции. Промежуточная доза 0,75 мг МВД привело к постепенному снижению пороговых значений, которые были на 80% ниже, чем контрольные солевой раствор порогов на 10-й день и остается на низком уровне до 28-й день Наибольшая доза 1 мг МВД был связан со знакомificant падение порога на 5-й день, и дальнейшее снижение на 10-й день, которое сохранялось до 28-й день.

Данные , представленные на рисунке 2 приведены примеры изменения веса подшипника, которые связаны с МИА инъекцией в коленных суставах. В этом наборе экспериментов, в то время как 0,5 мг MIA доза не вызывает существенных изменений в весе подшипников на протяжении периода исследования 28 дней, 0,75 мг MIA дозы приводило к значительному снижению веса несут ипсилатеральной лапой от 10-й день и далее. Следует отметить, что отношение веса асимметрия , связанная с 0,75 мг МВД может привести к переменной и противоречивые результаты различных исследований ^23. Вместо этого, доза 1 мг MIA , как правило , индуцирует воспроизводимую весовая нагрузка асимметрии и данные на рисунке 2 , показывают значительное снижение веса не образованные на ипсилатеральной заднюю лапу с 3 -й день до конца периода наблюдения. Как и ожидалось, SalIНеон у обработанных животных не показали никакого веса подшипника изменений.

Рисунок 1. Разработка механических аллодиния Сообщение МВД Инъекции. Отдергивания лапы пороги ипсилатеральной и контралатеральной задних лап оценивали до и после инъекции MIA (0,5, 0,75 и 1 мг / мышь) и солевым раствором (0,9% NaCl), п = 8 - 10 мышей / группа. * Р <0,05, ** Р <0,01, *** р <0,001 по сравнению с физиологическим раствором группе, получавшей; Двусторонний повторные измерения ANOVA с последующим Student Newman-Кеулса постфактум тест. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Развитие веса подшипника дефицитаs Сообщение МВД Инъекции. Изменения в распределении веса тела между двумя задними конечностями рассчитывались как [(вес несет на ипсилатеральной лапой / суммарному весу, образованные на ипсилатеральной и контралатеральной лапы) * 100] были оценены до и после инъекции MIA ( 0,5, 0,75, и 1 мг / мышь) и солевой раствор (0,9% NaCl), п = 8 - 10 мышей / группа. * Р <0,05, ** Р <0,01, *** р <0,001 по сравнению с физиологическим раствором группе, получавшей. Двусторонний повторные измерения ANOVA с последующим Student Newman-Кеулса постфактум тест. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

С помощью этой методики мы опишем предпочтительный способ индукции ОА-как боль в мыши с помощью внутрисуставной инъекции МВД в коленном суставе и оценки чувствительности к безвредные и вредные стимулы в задних конечностей. МИА инъекции связано с персистирующей болевое поведение, а именно измененном веса задней конечности подшипника и развитие упомянутого механического гиперчувствительность (аллодиния). Такие статические измерения могут быть дополнены анализа походки на беговой дорожке или с помощью анализа дефиле в свободно движущихся животных. Модели MIA реагируют на обычные уменьшающих боль терапии ^24, что указывает , что они могут быть полезны для различая терапевтических подходов. В то время как инъекция МВД не является технически трудным, суставной капсулы может быть пробиты в процессе инъекции, в результате утечки МВД снаружи капсулы, и последующей неспособности индуцировать токсичность хондроцитов. Действительно, системное введение МВД может привести к летальному исходу в грызунах ай возможные эффекты МВД на тканях и, кроме хондроцитов клеток могут запутать результаты, помимо того, что нежелательно. Таким образом, следует подчеркнуть, что большое внимание должно быть уделено инъекцией МВД, так как она является одним из важнейших компонентов модели, и доверие необходимо учесть, что инъекция происходит в суставном пространстве. Этот протокол позволяет достичь этого.

Описанные здесь протоколы направлены на обеспечение животных обеспечивают последовательные болевые реакции, подобные на протяжении испытательного периода. Кроме того , они позволяют регулировать тяжести заболевания путем изменения дозы МВД используется , чтобы вызвать патологии ^15,23. Быстрое индукция как болезненное состояние и боли, как поведение позволяют своевременную оценку болевых модифицирующих соединений. Это является преимуществом по сравнению с существующими хирургических и спонтанно разработки моделей ОА, которые могут занять более длительный период времени, чтобы развить повышенную чувствительность. Кроме того, в частности, для спонтанных моделей, болезнь Patholлогия не проявляется у всех животных (приблизительно 20 - 80% ^7), в то время как модель МВД связано со значительным заболеваемости ответчиков. Кроме того, спонтанные модели не подходят для измерения изменений веса подшипника, а ОА развивается в обоих коленях. При рассмотрении вопроса о поведенческих измерений, животные должны быть спокойным и расслабленным во время оценки. Это достигается, как указано в протоколе, к началу обучения перед началом записи измерений и повторяющимися обработки, что позволяет животным ознакомиться с экспериментатором. Ключевым моментом, чтобы уменьшить напряжение, чтобы использовать один и тот же экспериментатор для поведенческого теста по всему, как и постоянное изменение будет вызывать проблемы ранее упомянутые. Как и любая модель, модель МВД ОА имеет ограничения, такие как быстрота совместного разрушения, которая не похожа на медленное развитие ОА патологии у больных. Одним из способов преодоления этой проблемы было бы дополнить эту модель с суrgical модель ОА. Использование химической модели МВД в развитии соединения позволяет использовать профилактических и терапевтических протоколов за разработку и поддержание ОА-как боль. Наконец, модель МВД будет дополнять исследования фенотипических признаков нокаут-мышей, помогая глубже понять болезнь ОА.

None of the authors have competing interests or conflicting interests.

JSV поддерживается совместный грант ММ Европейской комиссией (ГАН 603191-PAINCAGE).