Экс Vivo культуры Чик мозжечка ломтиками и пространственно Целевые Электропорация ЗК прекурсоров

Мозжечка внешний слой гранул сайт крупнейшего транзитного усиления в развивающемся мозге. Здесь мы приводим протокол целевой генетической модификации к этому слою на пике распространения с использованием естественных условиях электропорации экс и культуры мозжечка ломтиками из эмбриональных день 14 куриных эмбрионов.

Мозжечка внешний слой гранул (EGL) является местом крупнейшей транзитной усиления в развивающемся мозге, и отличная модель для изучения нейронов пролиферации и дифференцировки. Кроме того, эволюционные изменения ее пролиферативной способностью были ответственны за резкого расширения мозжечковой размера в амниот, что делает мозжечок отличная модель для Evo-Devo исследований позвоночных мозг. Учредительные клетки EGL, мозжечка гранул предшественники, также представляют собой значительную ячейку происхождения медуллобластомой, одной из самых распространенных педиатрической нейронов опухоли. После транзитного усиления, гранул прекурсоров мигрировать в радиальном направлении внутренней зернистого слоя мозжечка, где они представляют большой нейронов населения в зрелом мозге млекопитающих. У кур, пик распространения EGL происходит в конце второй недели беременности. В целях выявления генетической модификации к этому слою напик распространения, мы разработали метод для генетических манипуляций через экс естественных условиях электропорации мозжечка ломтиками от эмбриональных день 14 куриных эмбрионов. Этот метод повторяет несколько важных аспектов в естественных развития гранул нейронов и будет полезен в создании полного понимания пролиферации мозжечка гранул и дифференцировки клеток, и, следовательно, развитие мозжечка, эволюции и болезни.

Мозжечок расположен у переднего конца заднего мозга и отвечает за интеграцию сенсорной и моторной переработки в зрелом мозге, а также регулирования более высокие когнитивные процессы ^1. У млекопитающих и птиц, это имеет продуманную морфологии и степени расслаивается, продукт обширного транзитной усиления предшественников в процессе разработки, который производит более половины нейронов в мозге взрослого. Мозжечок является предметом изучения для нейробиологов в течение многих столетий и в молекулярной эры также уделено значительное внимание. Это относится не только к его сути интересной биологии, но также в том, что она в значительной степени причастны к болезни человека, включая развития генетических расстройств, таких как расстройства аутистического спектра ^{2 и} наиболее важное мозжечка рака, медуллобластомой ^3, который является наиболее распространенным педиатрических мозга опухоли. Важно отметить, что это отличная модель системы в WHIch изучать распределение судьба и нейрогенез во время развития мозга ^4. В последние годы, он также был создан в качестве модельной системы для сравнительного исследования развития мозга, в связи с огромным разнообразием форм мозжечка видели по позвоночных филогении ^5-10.

Мозжечок развивается из дорсальной половине ромбомера 1 в заднем мозге и развитием ¹¹ состоит из двух основных популяций клеток-предшественников, ромбической губой и вентрикулярной зоне. Ромбической губы простирается вокруг спинного области нейроэпителия заднего мозга на границе с потолочной панели. Это родина глутаматергических возбуждающих нейронов мозжечка ^12-14. Желудочковая зона приводит к тормозных ГАМК нейронов мозжечка, наиболее заметно большие Пуркинье нейронов ^14,15. Позднее в развитии (от примерно 13,5 эмбриональный день у мышей; е6 в куриных ^16), глутаматергической Progenitors мигрировать касательной с ромбической губы и образуют слой мягкой мозговой оболочки клеток-предшественников: зона вторичного предшественников называется внешним гранул слой (EGL). Именно это слой, который подвергается обширной транзитной усиление, что приводит к огромным количеством гранул нейронов, найденных в зрелом мозге.

Распространение в EGL уже давно связан с суб-пиальных месте, что результаты от касательной миграции из ромбической губы ^17, с переходом на выходе клеточного цикла и дифференцировки нейронов предшественников, ассоциированных с их выходом из внешнего слоя EGL в середине EGL ^18. Обширная касательной миграция постмитотических зернистых клеток в медиальной-боковой оси происходит в середине и внутренней EGL ^19, до окончательного радиальной миграции во внутреннюю гранул слоем зрелой коре мозжечка. Миграция клеток из ромбической губы над мозжечка поверхности зависит от CXCL12 сигнализации от Пиа ^20-22 И ЗК выразить CXCL12 рецептор CXCR4. Их касательной миграция, таким образом, напоминает, что из неокортекса касательной миграции населения ингибирующие интернейронов ^23-25. Интересно, электронные микроскопические исследования ¹⁷ показали, что EGL клетки с пролиферативной морфологии поддерживать контакт мягкой мозговой оболочки, связывая поведение клеток с пролиферативной способности в манере, напоминающей базальных клеток-предшественников в коре млекопитающих ^26. Это нашло свое отражение в вышеупомянутом стратификации EGL в трех подслоев, которые определены различными внеклеточного сред и где гранулы прекурсоров отчетливое выражение гена подписи ^18.

Пролиферация клеток-предшественников в oEGL происходит с нормальным распределением размеров клонов, так что, когда предшественники отдельности генетически помечены в конце эмбрионального развития у мышей, они приводят к срединной среднем 250-500 г постмитотичностиranule нейроны ^27,28. Распространение зависит от митогенной сигнализации SHH от основных Пуркинье нейронов ^29-32. Способность реагировать на SHH было показано, что полностью зависит от клеточного автономной экспрессии фактора транскрипции Atoh1, как в пробирке ³³ и в естественных условиях ^34,35. Кроме того, выход клеточного цикла и дифференциации, как было показано, зависит от экспрессии ниже по потоку фактора транскрипции NeuroD1 ^36, которая, вероятно прямым репрессором Atoh1 ^37.

Несмотря на этот прогресс, и значительный продвижения в расшифровке биологическую основу клеток клеточного цикла выхода ^38-42, фундаментальная молекулярный механизм (ы), которые лежат в основе решения для выхода из клеточного цикла и перехода от предшественника к дифференциации нейрона, и Associated постмитотическими касательной миграции во внутреннем EGL, а также позднее переключательрадиальной миграции, по-прежнему полностью понял. Это в значительной степени из-за экспериментальной труднорешаемости в EGL: это поздно развивается, и трудно целевой генной так как многие из тех же молекул нейрогенных также важны в начале жизни гранул предшественников в ромбической губы. Чтобы преодолеть эту проблему, многие авторы разработали в естественных условиях и экс естественных условиях электропорации как метода целевым послеродовой мозжечка у грызунов ^43-48. Здесь мы пионерами использование экс виво электропорации в куриных изучать EGL, который представляет значительные преимущества с точки зрения стоимости и удобства. Наш метод электропорации и экс естественных среза культуры куриного мозжечка ткани использует ткани рассекают из эмбриональных день 14 цыплят на пике распространения EGL. Этот метод позволяет генетический адресности EGL независимо от ромбической губы и подготовить почву для генетического расчленения перехода от гранулпредшественников в постмитотичности гранул нейрона в мозжечке.

Примечание: Все эксперименты проводились с соответствии с Королевского колледжа в Лондоне, Великобритании и руководящих принципов по уходу за животными UK Главная Office.

1. Вскрытие E14 мозжечка

1. Выдержите коричневые оплодотворенной кур яйца на 38 ° С до эмбрионального дня 14.
2. Использование яиц ножницы обезглавить куриного эмбриона в яйце и удалить голову в чашку Петри, содержащую ледяной PBS (рис 1А).
3. Используя стандартные щипцы, сделать надрезы за каждым глазом весь путь через ткань, удаление глаза и верхнюю челюсть. Сделать второй разрез все путем глотки удаления нижней челюсти (рис 1B).
4. Используя стандартные щипцы, удалить всю кожу с поверхности черепа пилинг его от (рис 1С) и снимите лобной и теменной костей, выявление мозг.
5. С вентральной, удалить хрящи глотки и вспомогательного мезенхиму.
6. С дорсальной, осторожныLY удалить мезенхимы дорсальнее заднего мозга стараясь не повредить Пиа, и отдельный весь мозг (рис 1D).
7. Сделайте надрез на всем пути через ткань мозга и между мозге и отдельным мозге в том числе мозжечка (рис 1E).
8. Делая надрезы весь путь через ткани на обеих боковых стыках мозжечка и крыла пластины заднего мозга, мозжечок удалить всю, заботясь, чтобы сохранить целостность всей Пиа вскрытия (рис 1F). Снимите формирования сосудистого сплетения (рис 1G).
9. Перемещение расчлененный мозжечок в ледяную HBSS.

2. Кусочек Культура E14 мозжечка

1. Перевести весь мозжечок на стерильной платформе ткани Chopper с помощью шпателя или 3 мл пипетки Пастера с наконечником отрезать, чтобы расширить отверстие. Удаления избытка жидкости с помощью пипетки.
2. Вырезать весь целый мозжечок в тон потребовал ориентации при толщине 300 мкм с использованием тканей вертолет комплект с скорости резания на 50% от максимума. Целостности тканей наиболее легко сохраняется в сагиттальной разделе; Однако, ориентация также является важным фактором для анализа клеток (клеток Пуркинье являются дендриты сагиттально выравнивается, а ЗК аксоны работать поперек, перпендикулярно к плоскости клеток Пуркинье дендритов).
3. Использование 3 мл пипетки Пастера, покрыть ломтиками мозжечок в ледяной HBSS.
4. Перенесите ломтики в HBSS в 60 мм чашки Петри, содержащей ледяной свежий HBSS с использованием 3 мл пипетки Пастера с вырезом наконечником.
5. Под микроскопом рассекает освещаемого оптоволоконного источника света, убедитесь, разделение отдельных кусочков, используя щипцы часовщика. Определить ломтиками быть электропорации, на основе их целостности тканей и Medio-боковом положении.
   Примечание: Каждый из эмбриона рассечение через нарезать инкубации в культуральной среде занимает около 10-20 минут, в зависимости Upoн опыт. Выполните вскрытий по одному, чтобы убедиться, что мозжечка провести минимальное количество времени между обезглавливания и экс естественных условиях культуры.

3. Электропорация Ломтики

1. Построить электропорации камеру, фиксируя анод с электропоратора к основанию 60 мм чашки Петри с помощью изоляционной ленты. Добавить приблизительно 1 мл HBSS, чтобы покрыть электрод.
2. Поместите 0,4 мкм культуры вставку на верхней части электрода, покрытой HBSS с. Разрешить культура вставка для отдыха на электрод убедившись, что всегда с нами между вставкой и электродом.
   Примечание: В этой установке, культура вставка с кусочками будет опираться на поверхности раствора, поддерживая цепь, но позволяет пространственное нацеливание катода.
3. Передача выявленные ломтики (до пяти процентов культуры вставки) на культуры вставки, используя 3 мл пипетки Пастера с вырезом наконечником. Отдельная и позволяют оседать культуры вставки в sagittаль ориентации.
4. С помощью пипетки, удаления избытка HBSS, так что ломтики больше не залито раствором.
5. Использование пипетки P10, пипетки ДНК (при концентрации 1 мкг / мкл), разбавленный 20% быстрого зеленый над поверхностью целевой области среза. 20% быстро зеленый обеспечивает вязкий раствор ДНК и предотвращает чрезмерно широкий разгон ДНК. Добавить примерно 5 мкл ДНК / быстрый зеленый раствор для каждого среза (рис 2B).
6. Поместите катод над нужной ткани-мишени и электропорации с 3 х 10 В, 10 мс импульсов длительностью. Избегайте прямого контакта катода с тканью. Вместо этого, воспользоваться поверхностного натяжения жидкости для поддержания проводимости (разместить катод как можно ближе к ткани, как это возможно, фактически не касаясь ткани).
7. Повторите доставки ДНК и электропорацию нескольким регионах EGL на каждом отдельном мозжечка срез по желанию.
8. После завершения электропорации, передача культуры InSeRT 30 мм чашки Петри.
9. Для каждой культуры, добавляют 1 мл предварительно нагретого культуральной среды (базальной среды Eagle, 0,5% (вес / объем) D - (+) - глюкозы, 1% В27 дополнения, 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина) под культуры, такие вставки, что культура вставка находится в контакте со средой, но кусочки не залитом в нем.
10. Выдержите культур на 37 ° C / 6% CO ₂ в течение 3 дней. Заменить все культуральной среды через каждые 24 ч со свежим подогретого среды.
11. После культуры, исправить ломтики на культуру вставляет в течение 1 часа в 4% параформальдегида (или O / N при 4 ° С) в свежем 30 мм блюдо с не культуральной среде.

4. Визуализация мозжечка ломтиками

1. После фиксации, мыть ломтиками 3 раза в течение 5 мин в PBS.
2. Использование лезвие бритвы, рассекать каждый электропорации и культурный срез мозжечка из культуральной вставки путем разрезания вокруг среза и удаление фрагмента и область вставки он придерживался. ДелатьНе пытайтесь удалить кусочек от поверхности культуры вставки.
3. Mount ломтики в примерно 1 мл монтажа среде, содержащей DAPI (по желанию) под покровное, стараясь не ввести пузыри, и изображения с помощью лазерного сканирования конфокальной микроскопии.
   Примечание: Визуализация параметры могут быть изменены в соответствии с конструкциями электропорации, и по усмотрению индивидуального пользователя.

В этом разделе приведены примеры результатов, которые могут быть получены с помощью электропорации ломтик и культуры мозжечка из эмбриональных день 14 кур. Рассечение мозжечка показано на рисунке 1, и электропорации камера установка показана на рисунке 2. Покажем, что это возможно, чтобы электропорации и успешно культуры ломтики мозжечка, которые сохраняют свою структуру и клеточные морфологии в пробирке (рис 3а). Целевые электропорации в отдельных лепестков легко достигается (3В). Мы успешно электропорации ряд различных плазмид в клетки EGL и показать, что можно I), чтобы маркировать клетки репортер строит, чтобы наблюдать за их поведением (фиг.3С), II), чтобы проверить возможные геномных областей для функциональности мозжечка клеток (рис 3D ), и в) для манипулирования генетическиклетки в EGL по misexpressing белки интереса (рис 3Е). Кроме того, фармакологические манипуляции на электропорации ломтиками возможны (результаты не показаны). После культивирования можно выполнить дополнительный анализ тканей, таких как иммуногистохимических анализов или (пролиферации рис 3F). Мы проводим анализ здоровья тканей по кальбиндин и PH3 иммуноокрашивания и показать, что целостность ткани сохраняется в течение по крайней мере 3 DIV после культуры (рис 4). Эти результаты показывают, что EGL теперь доступным и легко манипулировать структура, которая может быть полностью изучены и генетически измененные в куриных модельной системы.

Рисунок 1. Препарирование мозжечка от куриных эмбрионов E14. (А) Обезглавьте цыпленок в яйце и удалить голову IntПетри О.А. ледяным PBS. Снимите нижнюю челюсть и глаза, делая разрез позади глаз и глотки (пунктирная линия). (Б) Удалить кожу с поверхности черепа. (С) Снимите лобной и теменной кости и (D) извлечь мозг из мезенхимы и хряща, окружающего его. (Е) при вскрытии микроскопом определить местоположение мозжечка на заднем конце головного мозга. Вырезать между мозга и заднего мозга (пунктирные линии), чтобы их оставили с мозжечком и брюшной мозге. (F) Сделайте надрезы на боковых стыков (плодоножек) мозжечка, чтобы отделить мозжечок от заднего мозга (пунктирная линия). (G) Удалить сосудистого сплетения (звездочка) с брюшной стороны мозжечка, пока вы не остались с целой неповрежденной мозжечка с Пиа прилагается. Перевести мозжечок в ледяной HBSS до подготовки срезов ткани Choppэ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. электропорации камере настроить. (A) картина на заказ электропорации камере. Камера состоит из анода в электропоратора размещены надежно на базе 60 мм чашки Петри. Чашку содержит приблизительно 1 мл HBSS, чтобы покрыть электрод. Вставка культура должна опираться на электроде с постоянным контактом между вставкой и электродом, поддерживая цепь, но позволяет пространственное нацеливание катода, которые управляются вручную. (B) картина из кусочков того электропорации. Кусочки покрыты ДНК / быстрый зеленый раствор. Ломтики электропорации как желаниеd: электропорации могут быть направлены в одну или лепестка нескольких местах. После электропорации вставка размещена в 30 мм чашки Петри с подогретого культуральной среде и культивировали в инкубаторе. 1. Анод 2. Катод 3. Культура вставка 4. Петри с 1 мл HBSS 5. рассекает микроскопом 6. Индивидуальные ломтики из ткани измельчитель 7. раствора ДНК с быстрым зеленого красителя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого фигура.

Рисунок 3. Представитель результаты. (А) небольшом увеличении картина управления электропорации ППП кодирования плазмиды в EGL в нескольких местах. Ткань сохраняет свою структуру и электропорации клетки хорошо видны в толстом слое subpial мозжечка. (Б)Пример целевого электропорации с плазмидой GFP управления. Целевая лепестка обозначается звездочкой. Масштабная линейка AB = 500 мкм. (С) пример, в котором конструкция, кодирующая GFP обусловлен энхансер Atoh1 был электропорации в EGL. Выражение Atoh1 определяет предшественников ЗК в EGL. Различные морфологии клеток четко видны на 3 DIV и поведение клеток могут быть отслежены. (D) Пример маркировки после электропорации конструктом, содержащим предполагаемую консервативный некодирующей элемент (CNE) гена GFP NeuroD1 движущей. НИК сообщает активность в клетках ожидаемых на основе эндогенного выражения NeuroD1 предлагая активную роль этого НИК в развитии. Выражение NeuroD1 коррелирует с началом дифференциации клеток гранулы. (Е) Пример, в котором ткань может быть генетически манипулировать неправильная экспрессия белка NeuroD1 и изменением Behav ЗКдение можно наблюдать. (F) Пример, где электропорации ткани (контроль GFP плазмиды) может быть фиксировали и окрашивали на маркеры пролиферирующих клеток, таких как phosphohistone H3 (PH3). Масштабная линейка CF = 50 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4. целостности тканей и пролиферации в культуре. (А - С) кальбиндин окрашивание E14 мозжечка ткани электропорации с GFP плазмиды управления на 1-3 дней в пробирке (DIV). Окрашивание кальбиндин показывает, что целостность тканей поддерживается в культуре в течение по крайней мере 3 дел. Слой клеток Пуркинье не образуют монослой на данном этапе развития куриного, но ясно видно, образуя слой подEGL, где ЗК (зеленые) расположены. (D), Phosphohistone Н3 (PH3) пятна на ткани мозжечка культивировали в течение 2 див. Окрашивание PH3 видна в EGL (стрелки), но также и в других регионах (мозжечка стрелки). Это окрашивание является представителем всех этапах культуры исследованных (1-3 дел). Масштабная линейка AD = 50мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Протокол сообщил здесь описан способ рассечения, электропорации и культивирование срезов эмбрионального день 14 мозжечка с птенцом. Этот протокол позволяет адресности электропорации малых фокусных регионов EGL, в том числе изолированных адресности отдельных мозжечка лепестков. Это дает возможность генетического анализа и визуализации с высоким разрешением и удобства, и при низкой стоимости по сравнению с известным методом грызунов ^43-47. Такой анализ в настоящее время невозможно в естественных условиях из-за длительного развития периода времени, малочисленность EGL-специфических возможностей генетического таргетинга у мышей, и общность молекулярных механизмов между ромбической губы и EGL, что означает, что изменения, которые могут повлиять на EGL биология зачастую не могут быть проанализированы, так как они влияют на нейрогенез ромбическую губ и отменить формирование EGL ^49. Таким образом, система представляет Наш большой прогресс в плане ориентации генетической модификации в EGL сpecifically, и мы ожидаем, что будет применяться к другим видам за птенцом, что, возможно сравнительного интереса, таких как не-модели млекопитающих и рептилий.

При выполнении технику электропорации кусочек культуры, ряд технических соображений имеют первостепенное значение. Во-первых, надежность ломтиками, чтобы выжить в культуре без с одной стороны проходит обширная гибель клеток или другой потери структурной целостности ограничивает толщину среза до 300 мкм в руках. Вторым важным фактором является вязкость раствора ДНК, что обеспечивает электропорации ДНК в концентрациях, которые достаточно высоки, чтобы вызвать видимые или соответствующие уровни генетической модификации. В, в ово электропорации растворов ДНК вводили в мозге раннего эмбрионального, концентрации красителя быстрого зеленого примерно 1% являются типичными. Тем не менее, в нашем протоколе, мы, как правило, используют концентрации быстро зеленый 20%. Это гарантирует достаточно отношениюкус раствор ДНК, чтобы предотвратить рассеивание ДНК следующий пипетки но до электропорации, но достаточно развести одну посредником эффективной электропроводности.

В дополнение к этим технических соображений, мы обнаружили, что пролиферативный поведение, которую мы наблюдаем исключая виво не точно соответствовать предсказанной в результате исследований in vivo с вероятно, связано с пиальных целостность быть нарушена препарата ткани. В таких условиях, когда выражение GFP конструкция электропорации, большая часть клеток электропорации, кажется, оставили в клеточный цикл после одного дня культуры, судя по PH3 окрашивания (рис 3F). Это не коррелирует с ожидаемой EGL пролиферативного поведения, где пролиферацию клонов в обоих мыши и цыпленка простирается на большой период времени ^27. Подразумевается, что Пиа модулирует пролиферацию поддерживается тем фактом, что, когда мы электропорации репортер строит с NeuroD1 регуляторный элемент движущей выражения GFP все электропорации клетки экспрессируют GFP после одного дня в культуре (рис 3D). В естественных условиях, эта конструкция зеркала эндогенного NeuroD1 выражение в маркировку клетки внутренней EGL, которые постмитотическими ^36,37, в то время как полная длина NeuroD1 достаточно водить дифференцировку клеток (рис 3E). Это говорит о том, что при определенных условиях, пролиферативная способность клеток может не поддерживаться, как и в наружной EGL в эквивалентных стадиях в естественных условиях. Окрашивание PH3 тем не менее полагаю, что есть много оружия в культуре, часто локализуется в области EGL (рис 4D). Обширная распространение за пределами EGL указывает, возможно, усиливается глиогенез или пролиферацию предшественников Pax2 GABAergic в белом веществе. Подразумевается, что интерпретация любого экспериментальной процедуры придется взять во внимание вышеизложенное proliferativе поведение, тот факт, что клетки Пуркинье не образуют монослой до E18 в куриных и что нормального развития может быть нарушена после подготовки ломтик (например, из-за отсутствия взаимодействия с восхождения волокна и т.д.)

Несмотря на эти ограничения, наш протокол представляет собой значительный шаг вперед в отношении к изучению многие аспекты гранул клеточной биологии. Решающим преимуществом включения пространственно и временно конкретную маркировку на EGL, в отличие от ромбической губы будут способствовать несколько экзаменов на обоих клеточной биологии из гранул предшественников и генетической регуляции, лежащих в основе его таким образом, что не возможно в настоящее время в естественных условиях. Наша методика в куриных будет дополнять существующие Экс Vivo культуры и электропорации протоколов у грызунов ^43-48 и несет значительные преимущества в стоимости и удобства, которые связаны с птенцом. Кроме того, он представляет собой значительный шаг вперед по сравнениюСуществующие методы культивирования гранул предшественников ^39. В то время как он будет дополнять, а не заменить его, наш протокол откроет контроль гранул нейронов дифференциации с широким разнообразием фармацевтических процедур и разнообразия клеточных автономных генетических манипуляций, которые можно у кур. Это обеспечивает основу для изучения биологии гранул клеток в беспрецедентных деталях.

The authors have nothing to disclose.

Метод, представленный в этой статье возник из работы, финансируемой по BBSRC BB / I021507 / 1 (ТБ, RJTW) и докторская стипендия MRC (МН).