Белки Трансфекцию Мышь легких

Трансгенные мыши или вирусные векторы были использованы для увеличения экспрессии белка в легких. Однако, эти методы требуют больших затрат времени, технически сложных и есть вне целевой эффекты, которые может поставить в тупик результаты. Наша белка трансфекции протокол использует на основе липидов реагента трансфекции и microsprayer ультрадисперсных равномерно доставки активных белков в клетках легких.

Increasing protein expression enables researchers to better understand the functional role of that protein in regulating key biological processes¹. In the lung, this has been achieved typically through genetic approaches that utilize transgenic mice^2,3 or viral or non-viral vectors that elevate protein levels via increased gene expression⁴. Transgenic mice are costly and time-consuming to generate and the random insertion of a transgene or chronic gene expression can alter normal lung development and thus limit the utility of the model⁵. While conditional transgenics avert problems associated with chronic gene expression⁶, the reverse tetracycline-controlled transactivator (rtTA) mice, which are used to generate conditional expression, develop spontaneous air space enlargement⁷. As with transgenics, the use of viral and non-viral vectors is expensive⁸ and can provoke dose-dependent inflammatory responses that confound results⁹ and hinder expression¹⁰. Moreover, the efficacy of repeated doses are limited by enhanced immune responses to the vector^11,12. Researchers are developing adeno-associated viral (AAV) vectors that provoke less inflammation and have longer expression within the lung¹³.

Using β-galactosidase, we present a method for rapidly and effectively increasing protein expression within the lung using a direct protein transfection technique. This protocol mixes a fixed amount of purified protein with 20 μl of a lipid-based transfection reagent (Pro-Ject, Pierce Bio) to allow penetration into the lung tissue itself. The liposomal protein mixture is then injected into the lungs of the mice via the trachea using a microsprayer (Penn Century, Philadelphia, PA). The microsprayer generates a fine plume of liquid aerosol throughout the lungs. Using the technique we have demonstrated uniform deposition of the injected protein throughout the airways and the alveoli of mice¹⁴. The lipid transfection technique allows the use of a small amount of protein to achieve effect. This limits the inflammatory response that otherwise would be provoked by high protein administration. Indeed, using this technique we published that we were able to significantly increase PP2A activity in the lung without affecting lung lavage cellularity¹⁵. Lung lavage cellularity taken 24 hr after challenge was comparable to controls (27±4 control vs. 31±5 albumin transfected; N=6 per group). Moreover, it increases protein levels without inducing lung developmental changes or architectural changes that can occur in transgenic models. However, the need for repeated administrations may make this technique less favorable for studies examining the effects of long-term increases in protein expression. This would be particularly true for proteins with short half-lives.

1. Подготовка реагентов трансфекции белков

1. Растворить Pro-Ject Реагент добавлением 250 мкл метанола и хлороформа в пробирку, содержащую сухой пленки.
2. Vortex в течение 10-20 сек при максимальной скорости.
3. Внесите 20 мкл Pro-Ject реагента в отдельные пробирки микроцентрифужные.
4. Выпаривают растворитель путем размещения микроцентрифужных пробирках, содержащих Pro-Ject реагента при ламинарном потоке в течение не менее 6 часов при комнатной температуре. Она должна быть абсолютно сухой. Кроме того, сухой Pro-Ject реагента использованием вакуум-эксикаторе.
5. Хранить трубы при -20 ° C. Они действительны в течение одного года при этой температуре.

2. Добавление белка Pro-Ject Реагент

1. 50 мкл PBS, содержащего 2,0 мкг белка, представляющего интерес, в пробирку, содержащую 20 мкл сухого Pro-Ject реагента для трансфекции.
2. После добавления белков, перемешать раствор при интенсивном перемешивании при низкой скорости Fили 3-5 с последующей инкубацией в течение 30 мин при комнатной температуре.

3. Интратрахеального введение белковых

1. Обезболить мышей путем внутрибрюшинной инъекции кетамина / ксилазина (100 мг / кг и 10 мг / кг).
2. После седативный эффект достигается, мыши подвешены на их верхних резцов с помощью специально разработанного платформе (Рис. 1).
3. Использование щипцов и скрепкой как ларингоскоп, ротоглотки открывается таким образом, что катетер может быть введен (рис. 2). Голосовые связки визуализируются путем размещения источника света против трахеи мыши.
4. Белок / проекта реагент смеси (50 мкл) вводили через трахею использованием Microsprayer Penn веке.

Чтобы продемонстрировать эффективность нашей методики мы использовали microsprayer (Penn Century) для введения в трахею мышей с 2 ​​мкг мышь альбумин (Sigma), растворенного в 50 мкл PBS, содержащий 20 мкл Pro-Ject реагента для трансфекции. Альбумин обработанных мышей по сравнению с мышами, которых обрабатывали идентичным образом с 2 мкг бета-галактозидазы белка (Pierce Bio). Через двадцать четыре часа, мышей умерщвляли и легких были обработаны для гистологического анализа. Иммуногистохимическое для бета-галактозидазы проводили на фиксированных формалином ткани легкого секции из альбумина и бета-галактозидазы мышей. Даже через 24 часа после трансфекции белков, мы обнаружили интенсивное окрашивание в дыхательных путях (большие стрелки), бета-галактозидазу мышей, но не альбумина мышей (фиг. 3А и 3В).

_upload/50080/50080fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Для позиционирования мышей внутритрахеальной инъекции, древесина платформа была построена, который имеет рампе под углом 45 ° от основания ^16. Мышах подвешены резцов с помощью металлической проволоки, которая прикреплена к двум металлическими крючками в верхней части рампы. Язык мягко приложена пинцетом и ларингоскопа скрепку используется, чтобы открыть дыхательные пути.

Рисунок 2. После размещения источника света на шеи, гортани могут быть визуализированы для внутритрахеальной инъекции ^16.

Рисунок 3. β-галактозидазы immunostains проводили на 4-мкм срезы легких у мышей вводили внутритрахеально с 2 мкгальбумин (А) или β-галактозидазы (B). Стрелки указывают β-галактозидазы окрашивание в дыхательные пути. Изображения при 40-кратном увеличении. Шкала бар = 100 мкм.

Преимущество этого метода по сравнению с другими методами является то, что он производит увеличение уровня белка и активность в легочной ткани непосредственно. Кроме того, он проникает в наиболее дистальных отделах легких в отличие от отдыха только в дыхательные пути. Мы измерили повышение активности белка в рационе наших инъектата даже после lavaging Airways физиологическим раствором ^15. Анализ тканей активности показывают, что белок в клетки и не только остаются в воздушные полости мыши. Это было дополнительно подтверждено иммуногистохимию демонстрируя диффузное окрашивание нашей вводится белка в альвеолах и дыхательных путей мыши (рис. 3). Важно отметить, что этот протокол не спровоцировать воспаление легких или экспрессии протеазы. Таким образом, любые изменения, которые происходят можно отнести к воздействию вводимого белка. Отсутствие воспалительного ответа позволяет использовать повторных инъекций для изучения эффекта на кордеГ периода времени.

Авторы не имеют конфликта интересов раскрывать.

Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья (7R01HL098528-03) и клинической премии Новатор FAMRI автора.