Метод для определения времени хода концентрации этанола в головном мозге крыс во время оперантного этанола самоуправления описано. Газовый хроматограф с пламенно-ионизационного детектора используется для количественного этанола в диализате образцы, поскольку она имеет чувствительность, необходимые для небольших объемов, которые генерируются.

Operant самоуправления методы широко используются для изучения поведенческих и фармакологических эффектов многих наркотиков, в том числе этанола. Тем не менее, этанол, как правило, самостоятельно вводят перорально, внутривенно, а не как и многие другие наркотики. Фармакокинетику пероральных препаратов являются более сложными, чем внутривенном введении наркотиков. Потому что понимание взаимосвязи между фармакологические и поведенческие эффекты этанола требуется знание хода времени этанола в мозг во время и после употребления алкоголя, мы используем в естественных условиях микродиализа и газовой хроматографии с пламенно-ионизационного детектора для мониторинга мозга концентрация диализата этанола с течением времени.

Комбинированные микродиализа-поведенческие эксперименты связаны с использованием нескольких методов. В этой статье стереотаксической хирургии, поведенческие обучения и микродиализа, которые могут быть адаптированы для тестирования множества самоуправления и нейтроновrochemical центре гипотез, включены только чтобы показать, как они относятся к последующим этапам сбора и анализа проб диализата этанола. Диализата анализа концентрации этанола с помощью газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектором, который является специфическим для этанола исследования, описан в подробностях. Данные, полученные с помощью этих методов выявления структуры этанола в мозг во время самоуправления процедуры, и когда в паре с нейрохимических анализа тех же образцов диализата, позволяет выводов, которые будут сделаны в отношении фармакологических и поведенческих эффектов этанола.

1. Стереотаксическая хирургия

1. Все процедуры следуйте инструкциям в руководстве NIH по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета.
2. Использование стереотаксического аппарата, хорошо обрабатывается Лонг-Эванс крыс, анестезированных изофлураном, имплантируются с 21-калибровочного канюли (для последующей вставки microdilaysis зонд) (Пластмасса Один из них, Роанок, Вирджиния) над мозгом область интересов, и троса Болт построен в голову этап (используется для поддержки микродиализа оборудования).
3. Мониторинг крыс тщательно во время и после операции. Убедитесь, что все животные получают по крайней мере одной недели послеоперационного ухода и восстановления и здоровы до начала следующих процедур. Юпитер видео стереотаксической хирургии метод доступен ^1.

2. Оперантного обучения

1. После недели послеоперационного восстановления, животные обучаются нажмите рычаг на 10% сахарозы Solutioп в оперантного Med Associates камеры (MedAssociates, Inc, штат Вермонт, США) оснащен lickometer, выдвижной рычаг, и трубка подачи трубы (как описано ранее в Говардом и соавт., 2009). ^{2 Программное обеспечение} от MedAssociates используется для создания всех оперантного программ (MedAssociates, Inc, штат Вермонт, США).
2. После обучения в ответ на сахарозу, начинают крыс на соответствующий график обучения в течение которого этанол постепенно добавляют в раствор за несколько сеансов пить.
3. Например, в нашей лаборатории в настоящее время использует 8-дневный график обучения, где этанол растворился в решении кульминацией 10% этанола / 10% раствор сахарозы пить. Контрольные животные получают только 10% сахарозы или не пить раствор. Конкретный тип оперантного графиком, который будет использоваться может широко варьироваться, но в целом процедур, описанных ниже микродиализа выборки все еще ​​может быть выполнена ^3.

3. Предварительно микродиализа процедуры: Tethering

1. В ночь перед вторым последней тренировочной сессии (в нашем примере это ^7-й тренировке), животные привыкли к весне трос, который крепится к троса болт на их головы стадии. Весной крепится к поворотной микродиализа и борьбе рычаг баланса, который подвешивается рядом с клеткой с подставкой кольца и зажимы, так что животное может свободно перемещаться в пределах своей клетке. Привязной животные проводят ночь в оперантного комнате, в своем доме клетку с объявления пищу без ограничений и воды, чтобы приучить их к привязывать настройки.
2. На следующий день, крысы завершает свою оперантного программы с троса на место, чтобы приучить животное к чувству троса при выполнении своих поведенческих задач. Установите привязывать аппарат к стене оперантного камеры вверху, чтобы подвески троса и поворотного над центром крыши оперантного камеры. Все это помещается в Шумозащитный камеры. AfteГ сессии, вернуть крысу в своем доме в клетке оперантного комнату, чтобы дождаться microdiaysis зонда вставки.

4. Предварительно микродиализа процедуры: микродиализа зонд вводится за день до микродиализа эксперимент, после крысы завершил обучение поведенческим на день

1. За день до микродиализа эксперимента, после того, как крыса завершил сессию оперантного в то время как привязанный, обезболить крысы с изофлурана и снять затвор с направляющей канюли. Медленно (в течение ~ 5 мин) вставить микродиализа зонд, перфузировались с искусственным спинно-мозговой жидкости (ACSF), через черепную канюли руководство в области мозга интерес. Мы используем лабораторные построен зондов и микродиализа процедур по образцу Doyon и соавт., 2003 и Петтит и юстиции, 1991 год. ^{3, 4}
2. Используйте обсуждалось ранее привязывать аппарат приостановить на входе и выходе линии зонда над животными.
3. Поверните рхалат расход до 0,2 мкл / мин. Опять же, крыса проводит ночь в оперантного комнате.

5. Микродиализ процедур: сбор образцов в процессе самоуправления сессии аппетит и consummatory фаз, разделенных

1. По крайней мере 2 часа до начала эксперимента начинается, поднимите зонд к его рабочей скорости потока. Мы используем либо 1,0 или 2,0 мкл / мин в зависимости от области мозга. Проверьте, что скорость зонда поток последовательно, и по крайней мере 90% установленный расход с помощью шприца Гамильтона для измерения объема с течением времени.
2. Диализ образцов (5 или 7 мин) принимаются до, во время и после оперантного сессии. Интервал выборки зависит от области мозга, нейротрансмиттеров анализируются, диализате концентрация анализируемого вещества, и чувствительность аналитического оборудования химии, которые будут использоваться для анализа. Поведенческих фаз следующим образом:
   1. Исходные данные: В начале эксперимента,сбор образцов диализа в домашних клетку животного (4 пробы).
   2. Перевод: После сбора образцов домой клетку базового уровня, передает крысы оперантного камеры. Передача привязанный крысы требует крайней осторожности, чтобы убедиться, что передача микродиализа трубопровод не запутаться, и что крысы остается спокойной. Сразу же после передачи, активируйте оперантного программа, как вы измените от базового / передачи образца первого образца ожидания.
   3. Подождите: Продолжайте собирать образцы, как крыса ждет рычаг, чтобы продлить в камере (3-4 образцов в зависимости от области мозга).
   4. Напитки: После рычаг представлены и нажал, бутылку питьевой раствор (10% sucrose/10% этанола и 10% сахарозы), доступное для крыс около 20 минут (3-4 образцов).
   5. Сообщение напитка: После напиток период, бутылки убирается, но остается крысой яп оперантного камеры около 20 минут (3-4 образцов).

6. Микродиализ процедуры: подготовка микродиализа образца для анализа этанола

1. Два образца до животных самостоятельно управлять раствор этанола, и все образцы после, оцениваются по концентрации этанола. Внесите 1 или 2 мкл аликвоты из образца интерес в 2 мл стеклянный пузырек. Затем запечатайте пробирку с герметичной перегородкой (9 мм Красный Poly винтовой крышкой, PTFE / Sil Septa, Agilent Technologies). Объем аликвоты этанола анализа (1 или 2 мкл) зависит от общего объема образца и образца объем, необходимый для дополнительного анализа.
2. Если образцы будут использованы для последующего анализа нейрохимических, хранить надлежащим образцом после пипеткой аликвоты для производства этанола количественной оценке.
3. Например, наша лаборатория анализирует образцы для допамина. Для этого поместите образцы в сухом льду во время эксперимента, а затем хранить образцы при -80 ° С после эксперимента. Мы используем 2 мкл аликвоты для анализа этанола в 5 мин образцы собраны с использованием скорости потока 2,0 мкл / мин для зонда помещается в прилежащего ядра. Это позволяет по крайней мере, 7 мкл оставшихся для последующего анализа дофамина высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией.
4. Для образцов, взятых из префронтальной коры, которая имеет намного более внеклеточной концентрации дофамина, мы используем в 1 мкл этанола анализа взяты из 7-мин образца с использованием скорости потока 1,0 мкл / мин.

7. После процедуры микродиализа

1. После заключения микродиализа эксперимент, обезболить крысы и снимите датчик. Заменить обтуратор, если животное не сразу усыпляют. Сбор мозга в течение трех дней эксперимента. В противном случае, визуализация зонда тракта может быть невозможным.
2. Мозг должен быть удален яN соответствии с утвержденными протоколами использования животных. Мы используем пентобарбитала натрия (150 мг / кг, внутрибрюшинно) передозировку, а затем сердечной перфузии физиологическим раствором формалина, а затем в солевом растворе. Погрузитесь мозга в формалине солевой раствор, по крайней мере за 12 часов до секционирования.
3. Коронки раздел мозга в 100 мкм ломтиками. Пятно ломтики с крезиловый фиолетовый, и изучить для правильного размещения зонда. ^{5, 6}

8. Анализ образцов для концентрации этанола

1. Собранные образцы, а также внешние стандарты (0,3125 - 20 мм этанол) будут работать на нашу газовый хроматограф с пламенно системы обнаружения ионизации. Эта система состоит из Varian CP 3800 газовый хроматограф с детектором ионизации пламени, Bruker (Varian) 8400 автосамплера свободное пространство нагревается до 50 ° C, и HP Innowax капиллярной колонкой (30 м х 0,53 мм х 1,0 мкм толщины пленки), с гелия в качестве подвижной фазы.
2. Хроматограммы записываются и анализируются с Chromatography программ, таких как Varian звезды хроматографии рабочей станции программное обеспечение, которое будет специально обсуждаться здесь.
3. Для подготовки системы для анализа этанола, нагревают пластины автосамплера использованием оборотной воды ванну, и открыть два дополнительных бака газом (воздух и водород, гелий всегда остается под управлением сохранить воск колонке).
4. Запись топливный бак давления, а также количество образцов вы намереваетесь работать, так что вы можете вести учет того, сколько раз волокно и перегородки были использованы, так что они могут быть изменены в случае необходимости (волоконно-500 инъекций; перегородки -100 проколы).
5. Начало запуска метода, который готовит систему для запуска проб (параметры программы в таблице 2). Подождите, пока система сообщит, что он "Ready".
6. Посвященный 20-мин "гореть", который готовится волокна для анализа проб, подвергая его воздействию высокой температуры для десорбции любых загрязнений она вобрала в то время как в состоянии покоя.
7. Стандарты сделаныразбавления 238 мкл 95% этанола с водой до конечного объема 100 мл, используя мерную колбу в химическом вытяжном шкафу. Это создает 40 мМ раствор этанола. Мы используем в соотношении 1:1 серийного разведения создать 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125 мМ стандартам. Для каждой концентрации стандарта, использовать тот же объем аликвоты, которые будут приниматься от диализа образцы. Внесите Аликвоту в 2 мл стеклянную пробирку, а затем запечатать флакон с герметичной перегородкой.
8. Все образцы этанола нагревают в пробоотборником, пока вся жидкость аликвоты была испаряется. Мы нагреваем наших образцов в течение примерно 30 мин.
9. В этом разделе описывается программное обеспечение Звезда рабочей станции, которую мы используем с нашими газовый хроматограф. Другие программы могут быть использованы, но описание ниже, не могут быть применимы.
10. Для запуска образцов, создать примерный список отметив, которое образца, в котором пробоотборником слот, и сколько раз образец должен быть проколот. Будьте уверены, что маршрут файлы данных на выбранные разаэ. Затем выберите метод выбора для ваших образцов и начать перспективе. Мы используем работает параметров, указанных в таблице 2.
11. Наша программа диализата этанола поглощает образец в течение 3 мин и десорбируется в поток гелия, который питается воском в колонке, в течение 1 мин. Тем не менее, программы могут быть написаны с учетом ваших конкретных потребностей.
12. Отдельные компоненты пробы в колонку воска, а затем пройти через детектор ионизации пламени, где углеродсодержащих соединений, таких как этанол, сжигать и освобождение ионов. Это приводит к увеличению потока электронов от анода детектора к катоду, создавая ток, который преобразуется в напряжение и записал в результате хроматограммы, как показано ниже (рис. 1). Изменение напряжения пропорционально количество углерода, проходящего через детектор через time.7
13. После того как система закончит работу примеры, которые вы должны будете проверить интеграцию каждого пика. Для программного обеспечения рабочей станции Star,нажмите на синий значок пика в панели инструментов. Нажмите на цвет каждого пика и перетащите стрелки для настройки базового уровня. Реинтегрировать каждого пика, прежде чем перейти к следующей группе пиков. Пик программного обеспечения для анализа может быть любое программное обеспечение общего хроматографии.
14. Для программного обеспечения рабочей станции Star, нажмите на значок партии отчета в панели инструментов. Перетащите каждого образца из вашей указанную папку в пакет отчет для печати образцы отчетов. Отчетный программного обеспечения могут быть настроены с наиболее распространенными системами хроматографии программного обеспечения.
15. Отчеты могут быть запрограммированы для отображения информации на ваш выбор. Мы в настоящее время используют высота пика, но отчеты также могут быть запрограммированы, чтобы использовать площадь пика.
16. Чтобы выключить систему, инициировать отключение метод (параметры указаны в таблице 2), выключить водяной бане, и закрыть водорода и воздуха танки, когда температура термостата колонки достигает 30 ° C.

9. Этанол данных

1. Постройте высота пика, какФункция каждого известного внешнего стандарта концентрация этанола (рис. 2A). Используйте линейные функции, заданной этими точками для расчета концентрации этанола от высоты пика дается каждому диализата образца.
2. Построив концентрация этанола в диализате в течение долгого времени, мы можем увидеть образец этанола уровней в области мозга, интерес во время нашей поведенческой сессии. Пример данных, как показано ниже (рис. 2В), представлены в виде концентрации этанола в диализата через время, в течение самоуправления сессии.

10. Общее техническое обслуживание: волокна должны быть изменены каждые 500 проколов, и перегородки каждые 100 проколов

Чтобы изменить волокна

1. На газовый хроматограф клавишу Меню панели нажмите, выберите 8400, нажмите клавишу ввода, выберите изменений шприц, нажмите клавишу ввода. Автосамплера будет позиционировать себя, чтобы волокна (SPME волоконно Ассамблеи, 75 мкм Carboxen-PDMS, Supelco аналитический, BellefoNTE, PA) должны быть удалены.
2. Откройте дверь, охватывающих волокна. Отвинтите контргайку и переместите защелку, чтобы волокна сборки должны быть удалены. Возьмите волокно из собрания. Отвинтите гайку, которая держит волокна в сборке, а затем открутить волокна.
3. Замените старые волокна с новым, и собрать волокна сборки. Замените сборку в пробоотборником, вновь фиксации и завинчивания сборки на месте. Когда вы закончите, нажмите кнопку "изменить сделано" на клавиатуре, и автоматический пробоотборник будет готова сама для использования.

Чтобы изменить перегородки

1. Во-первых, открутить колпачок, закрывающий перегородку (Привет-Temp 0,450 Dia. Generic условные Septa, Varian), а затем удалить старые перегородки. Сиденье новые перегородки вниз в примерочную. Повторно завинтите крышку и затяните его с помощью гаечного ключа. Затем, с помощью инъекционной иглы для прокола перегородки так, что волокна не сломается в первый раз перегородки проколот.

11. Представитель Результаты

На рисунке 1 показан пример хроматограммы для трех концентраций этанола стандарты и образцы крысы диализата собраны в конце этанола самоуправления сессии. Этанол пики должны быть относительно симметричны, имеют постоянное время удержания, а соотношение сигнал-шум> 10. Невыполнение этих критериев означает, что ваша система требует технического обслуживания. Хроматографии качества и правильно подготовлены стандарты производства линейной калибровочной кривой (R2 ≥ 0,99; рис. 2A), которые используются для расчета концентрации этанола диализата образцов, взятых из этанола самоуправляющихся животных на протяжении их самоуправления сессии (рис. 2В) .

Рисунок 1. Пример хроматограммы. Один мкл стандартного этанола или диализата образец был загружен в газе сhromatograph флакон и анализировали, как описано в тексте. А) наложение пиков, полученные от 2,5, 5,0 и 10 мм Стандарты этанола. B) Пик, полученные от диализата выборки из крыса, которая имеет самоуправляемые этанола.

Рисунок 2. Графическое результатов на примере эксперимента показана на рисунке 1. А) Этанол стандартной кривой. Б) время хода диализата концентрации этанола на этаноле самоуправления сессии.

Таблица 2. Газовый хроматограф с пламенно-ионизационным параметров системы обнаружения. В данной таблице приведены параметры для трех программ, используемых для подготовки (запуск установки), работа (настройки) и поддержание системы, а не в использовании (в состоянии покоя настройки).

Приложения и ограничения

Наркотиков самоуправления используется в модели грызунов наркомании. Многие наркотики, которые смоделированы таким образом можно вводить внутривенно, в которых препарат доставляется непосредственно в центральный отсек. Это позволяет тщательный контроль дозы в течение самоуправления сессии. Поскольку этанол, как правило, устно самоуправляемой, это гораздо труднее контролировать уровень препарата из-за индивидуальных различий в поглощении и метаболизме. С помощью микродиализа на выборке из области мозга, интерес, мы не только не в состоянии контролировать картину этанола достижения региона, но мы также в состоянии одновременно контролировать нейромедиатора изменений в этом же регионе в течение долгого времени в течение каждого самоуправления фазу.

Нейрохимические изменения и медикаментозный реакции в мозге, связанных с злоупотреблением наркотиками и зависимость, таким образом, возможность одновременно измеренияуверен, нейрохимических и концентрации препарата в течение определенного самоуправления фаз обеспечивает очень мощный и уникальный инструмент. Один из вопросов, иметь в виду, для сопоставления диализата концентраций аналитов с поведение физических характеристик микродиализа сантехника. В частности, время, необходимое для жидкостей должны быть переданы из просвета микродиализа зонд для сбора трубка имеет решающее значение, и более короткие сроки, тем лучше. В нашей лаборатории мы построим зондов, так что время составляет около 90 секунд. Используя эти условия, мы обнаружили, что есть accumbal увеличения допамина в момент начала потребления этанола, который уменьшается в течение этого напитка и после напитка периоды диализата увеличением концентрации этанола. ^2,3,8,9 Эти эксперименты В сочетании с данными фармакологических исследований, которые позволили нам разобрать строго фармакологические эффекты этанола и самоуправления связаны сигналами окружающей среды на СНАнгелов в нейромедиатора концентрации.

Следует отметить, что это конкретное применение комбинированных поведенческих методов микродиализа подходит для текущей научных интересов нашей лаборатории. Он предназначен для оценки временных структур этанола в мозг по сравнению с картины нейромедиаторов изменяется в том же регионе, так что мы можем связать эти меры для синхронного самоуправление поведением. Полученная концентрация диализата этанола не корректируются для восстановления зонда в естественных условиях, и лишь часть из ткани концентрация этанола мозга. Если количественные микродиализа этанола требуется, добыча доля этилового спирта, что диффундирует из внеклеточного пространства в зонд должен быть определены экспериментально. См. предыдущие публикации из нашей лаборатории методов и дальнейшего обсуждения. ^10,11,12

Хотя этот протокол иллюстрирует использование газа чromatography вместе с твердой фазой микроэкстракции этанола из свободном пространстве микродиализа образцы, другие методы для анализа содержания этанола в микродиализа образца могут быть использованы. Тем не менее, альтернативные методы могут страдать от некоторых недостатков. Например, менее чувствительных аналитических методов может потребовать большего объема образца которая требует выборки раза больше, чем 5-7 мин показано на рисунке. Тип системы обсуждается здесь используются твердые микроэкстракции фазу, которая концентрирует этанола в паровой фазе в запечатанном флаконе образца, позволяя поглощения волокна помещают в пробирку свободного пространства. Это повышает предел обнаружения по сравнению с прямой отбор проб паровой фазы, которая обычно позволяет 50-100 мкл пара для инъекций. Еще одним важным преимуществом метода является то, что свободного пространства образца вводится для анализа чрезвычайно чиста и свободна от солей. Прямой впрыск жидкого образца микродиализа также может быть использован с большей СЕНСИТivity, но это потребует больше инструментов вниз время из-за регулярного технического обслуживания необходимо для чистки вводят соли.

Устранение неисправностей и другие заметки

1. Прежде чем ваш эксперимент начинается, дайте себе достаточно времени, чтобы убедиться, что ваш микродиализа установок функционируют должным образом и устранения неисправностей любые вопросы. Мы предполагаем, что у вас есть дополнительные настройки, перфузию ACSF, готовы перейти с неисправной установки, чтобы сэкономить время, так как большинство оперантного сессий, как правило, происходят в определенное время каждый день.
2. Будьте уверены, что микродиализа зонды вводятся в течение приблизительно 5 минут, чтобы свести к минимуму повреждение тканей производится срез ткани, как зонд проникает в мозг.
3. При передаче крыс в оперантного камеры было бы полезно иметь второй человек оказания помощи таким образом, чтобы линии передачи (часть микродиализа настройки) не становится запутанной, и так, что оперантное программа может быть инициализацииiated от времени.
4. Убедитесь, что вы даете ванну воды пробоотборником много времени, чтобы достичь нужной температуры. Наша система обычно требуется два часа, чтобы достигать 50 ° C. Кроме того, убедиться, что ваши образцы полностью испаряется, прежде чем анализировать образцы. Как правило, мы визуально подтвердить, что это произошло перед началом анализа проб.
5. Стандартный хорошие аналитические практики химии должны быть соблюдены. Они включают, но не ограничиваются, проверка лиц, оборудования и процедур. Короче говоря, мы используем следующие принципы: Отдельные пользователи должны продемонстрировать способность генерировать воспроизводимый пиковых значений высоты для стандартной концентрации и линейными стандартными кривыми (R2 ≥ 0,99) на несколько дней. Для проверки GC-FID система работает правильно, стандарты должны быть всегда быть проанализированы до того, как образцы диализата вводится. Стандартной кривой, полученной должны R2 ≥ 0,99.
6. Большая часть оборудования мы используембыл приобретен через Varian, Inc, которая была приобретена компанией Agilent Technologies в 2010 году. В это время, Bruker Scientific Instruments получил лабораторию Вариан газовой хроматографии инструментов бизнеса. Для будущих покупок, проконсультируйтесь либо компании.
7. Настоящий протокол показывает, оперантное поведение крыс, но зритель должен знать, что больше нарушений поведения, вероятно, произойдет с меньшим мышиной модели. Еще один вопрос, чтобы быть в курсе, что размещение микродиализа зонд в мозг других регионах, кроме медиальной префронтальной коры или прилежащего ядра может нарушить оперантное поведение в большей степени, чем показано здесь. Важно внимательно изучить многочисленные поведенческие параметры, чтобы определить ущерб, нанесенный зонд размещения вызывает серьезные изменения в поведении.

Эта статья была профинансирована Med Associates, Inc

Это исследование было поддержано грантами NIH / NIAAA (AA11852 и AA007471).