Фенотипическая и функциональная характеристика эндотелиальных колониеобразующих клеток, полученных из человеческой пуповинной крови

Эндотелиальных клеток, образующих колонии (ECFCs) циркулируют эндотелиальных клетках с надежными клонального пролиферативный потенциал, которые отображают внутренние В естественных условиях Судно формирование способности. Фенотипические и функциональные характеристики результат эндотелиальных клеток, полученных от ЦБ имеют важное значение для выявления и изоляции Добросовестных ECFCs потенциального клинического применения в восстановлении поврежденных тканей.

Многолетние виды новых кровеносных сосудов через ангиогенез, васкулогенез и arteriogenesis были недавно рассмотрены ^1. Наличие циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников (EPC), впервые были определены в взрослого человека периферической крови Асахара и соавт. В 1997 г. ² чего приток новых гипотез и стратегий для регенерации сосудистой и ремонт. ЕРС редки, но нормальные компоненты циркулирующей крови, что дома на сайты кроветворения судна или сосудистого ремоделирования, а также содействовать или послеродовой васкулогенез, ангиогенез, или arteriogenesis основном через паракринной стимулирование существующих сосудистой стенки клеток, полученных из ^3. Никаких конкретных маркеров для идентификации EPC был определен, и в настоящее время состояние поля, чтобы понять, что многие типы клеток, в том числе проангиогенных гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток, циркулирующих ангиогенных клеток, Tie2 ⁺ моноцитов, предшественников миелоидного челLS, опухоли связано макрофагов и М2 активированными макрофагами участвовать в стимулировании процессов ангиогенеза в различных доклинических модельных систем животных и у человека в различных болезненных состояний, ^{4, 5.} Эндотелиальных клеток, образующих колонии (ECFCs) встречаются редко циркулируют жизнеспособные клетки эндотелия характеризуется надежной клонального пролиферативный потенциал, вторичные и третичные колониеобразующих способность на replating и способность образовывать внутренние сосуды в естественных условиях при трансплантации в иммунодефицитных мышей ^6-8. Хотя ECFCs были успешно изолированы от периферической крови здоровых взрослых, пуповинной крови (ЦБ) здоровых новорожденных, а стенки сосуда многочисленных человеческих артериальных и венозных сосудов ^6-9 ЦБ обладает самой высокой частотой ECFCs ^7, дисплей самый надежный клонального пролиферативный потенциал и прочный вид и функциональные кровеносные сосуды в ^{8 естественных, 10-13.} В то время как при выводеECFC от взрослых периферической крови было представлено ^{14, 15,} здесь мы описываем методологию для вывода, клонирования, расширение, и в пробирке, а также в естественных условиях характеристики ECFCs от человеческой пуповинной ЦБ.

Реагенты и решения

EMG-2 средства массовой информации (Lonza, Кат. См-3162 содержащие ДМ-2 базальной среды и EGM-2 добавки SingleQuot комплект, и факторы роста)

ДМ-2 (Lonza, Кат. CC-3156) дополнить весь комплект SingleQuot добавки и факторы роста (Lonza, Кат. CC-4176), 10% (объем / объем) фетальной телячьей сыворотки (FBS) и 1% (объем / объем) пенициллина (10000 ЕД / мл) / стрептомицина (10000 мкг / мл) / амфотерицин (25 мкг / мл). Храните до 1 месяца при температуре 4 ° C. Рекомендуемые EGM-2-х томах использовать для ECFC культуры 500 мкл / лунку 24-луночных, 2 мл / и 6-луночных, 5ml/25-cm ² фляги, и 10 ml/75-cm ² колбы, если иное не указано в протоколе.

Коллаген я решение

Развести 0,575 мл ледяной уксусной кислоты (17.4N) в 495 мл стерильной дистиллированной воды (0,02 N конечной концентрации). Стерильные фильтр разбавленной уксусной кислоты с 0,22-мкм пылесосвакуумного система фильтрации. Добавить 25 мг крысы хвост коллагена I к разбавленной уксусной кислоты до конечной концентрации 50 мкг / мл. Количество коллагена добавил будет варьироваться в зависимости от концентрации фондового коллагена. Храните до месяца при 4 ° C.

Подготовка коллагена I-покрытие поверхности ткани культуры

Место 1 мл коллагена I решения в каждую лунку 6-и культуре тканей пластины (используется 300 мкл / лунку 24-луночных, 3ml/25-cm ² фляги, и 8 ml/75-cm ² колбы). Инкубируйте 1 час ночи при 37 ° C. Удалить коллагена I решения и мыть поверхность в два раза, каждый раз с PBS (используйте 500 мкл / лунку 24-луночных планшетов, 2 мл / и 6-луночных, 5ml/25-cm ² фляги, и 10 ml/75 -см ² колбы). Использование плит непосредственно на клеточных культурах.

FACS окрашивания буфер

Фосфат-солевом буфере (PBS) с добавлением 2% (объем / объем) эмбриональной телячьей сыворотки (FBS). Магазин ур до 2 недель при температуре 4 ° C.

А. ECFC результат клонирования и расширения

1. Соберите ЦБ с гепарином (10 ед гепарина / мл крови) или ЭДТА в качестве антикоагулянта и транспортировки в лабораторию при комнатной температуре и немедленно (в течение 2 часов после родов ребенка) процесс образцом для мононуклеарных клеток (МНК) изоляции.
2. Алиготе 15 мл ЦБ на каждые 50 мл конические трубки центрифуги и добавить 20 мл PBS в каждую пробирку ЦБ и пипетки несколько раз перемешать. Составьте 15 мл Ficoll-Paque в 20-мл шприц и присоедините 20G иглу или канюлю смешивания. Поместите кончик канюли смешивания в нижней части трубы разведенной крови и аккуратно легли в основу 15 мл Ficoll-Pague. Центрифуга трубы 30 мин при 740 мкг, при комнатной температуре, без установки тормозных торможение.
3. Использование передачи пипетки удалить туманным слоем низкой плотности ТНК расположен на границе между Ficoll-Paque и разреженной плазмы. Внесите МНК в 50 мл коническую трубку продолжениеaining 10 мл EGM-2 средних. Центрифуга МНК 10 мин при 515 мкг, при комнатной температуре, с высоким значением параметра тормоза замедление.
4. Тщательно аспирации и отказаться от супернатант. Вымойте гранулированных клеток с EGM-2 в два раза (10 мин при 515 мкг) и повторно приостанавливать ТНК в EGM-2 1,25 х 10 ⁷ клеток / мл. Подготовить коллагена I покрытием 6-луночных культуры тканей путем добавления 1 мл крысы хвост коллагена типа I (50 мкг / мл) в каждую лунку и инкубирования пластин в одночасье. Внесите 4 мл этой суспензии МНК в каждую лунку и поместить клетки в 37 ° C, 5% СО ₂ увлажненном инкубаторе. A.1.5) После 24 часов (1 день), медленно удалять отработанные среды (не беспокоить свободно присоединенными клеток) из колодца с помощью пипетки, медленно добавляют 4 мл EGM-2 к колодцу, и вернуть пластины в инкубатор . На 2-й день, обновите среды медленно удаления среды (не беспокоить свободно присоединенными клеток) из колодца с помощью пипетки и добавить 4 мл EGM-2 в каждую лунку. Повторите среды меняются ежедневно ООНсезам день 7 и через день после этого, пока ECFC колонии появляются для клонирования. Обычно колонии появляются между 5-й день, а день 14 дней ⁷ (рис. 1).
5. Визуализация типичный ECFC колонии с булыжником морфологии использованием инвертированного микроскопа (увеличение 10х) и отметьте колонии границы с маркером на нижней стороне также указать положение каждой колонии.
6. На 14-й день, мыть эти первичные колонии 2 раза PBS и урожай отдельных колоний использованием клонирования цилиндров и достаточно TrypLE экспресс, чтобы покрыть клетки внутри цилиндров. После аспирации последней промывки ФСБ, поместите стерильный гель покрытием цилиндров клонирования вокруг каждой колонии и сильно нажмите на панели с помощью стерильного пинцета. Добавьте 2-3 капли теплого TrypLE экспресс в каждый цилиндр клонирования и инкубировать в течение 3-5 мин, пока клетки в цилиндр начинает отделяться. Добавить 250 мкл среды EGM-2 в центре цилиндра и пипеткой вверх и вниз, чтобы гenerate суспензии отдельных клеток. Передача суспензии отдельных клеток друг от клонирования цилиндр отдельно в отдельных микро-центрифуги трубы.
7. Вымойте область внутри цилиндра в 2-3 раза с 250 мкл EGM-2 средних, чтобы собрать все остальные клетки и передать стирка от каждого цилиндра в соответствующих микро-центрифуги трубы. Центрифуга клетки с высокой скоростью (≤ 300 мкг) на настольной центрифуге в течение 5 мин.
8. Удалить супернатант и повторно приостанавливать осадок клеток в 1,5 мл свежей EGM-2 средних. Передача клеточной суспензии (содержащий все клетки из отдельных колоний) из каждой пробирки в одну лунку 24-луночного культуре ткани пластины предварительно покрытых 500 мкл крысы хвост коллагена I (50 мкг / мл).
9. Место внутри инкубатора для расширения со средствами массовой информации изменить выполняться каждый день.
10. Когда клетки подходят 80-90% слияния, удалить провел среднего затем промыть клетки 2 раза PBS и добавьте 500 мкл TrypLE экспресс среду в каждую лунку24-луночного планшета для культуры ткани. Поместите пластину внутри инкубатора в течение 3-5 мин, пока клетки начинают сгонять и снять. Добавить 1 мл EGM-2 (с 10% определен FBS) в каждую лунку для сбора клеток мытья и передавать их на 15 мл трубку. Вымойте и 1 мл EGM-2 средних, чтобы собрать все остальные клетки и передают друг от мытья и в соответствующие 15 мл трубку. Центрифуга клеток при 300 мкг в течение 5 мин.
11. Удалите среду и вновь приостановить осадок клеток в 1 мл свежей EGM-2 средних (с 10% определен FBS). Получить количества жизнеспособных клетки аликвоты помощью hemacytometer и трипанового синего исключения.
12. Развернуть клеток посева около 5000 клеток / см ² на коллаген я предварительно покрытых тканью культуры поверхностей в EGM-2 средства массовой информации со средствами массовой информации меняются каждый день, пока клетки подходят 80-90% до слияния высеве снова.

B. В пробирке Фенотипическая характеристика ECFCs: эндотелиальных клеток поверхностного антигена Выражениег Одноместный Анализ сотового для Клональный пролиферативный потенциал

1. Для эндотелиальных выражение поверхностный антиген клетки, отделить клетки TrypLE экспресс собирать клетки с помощью методов, описанных в ECFC клонирования и расширения.
2. Повторно приостанавливать клеток в буфер окрашивания FACS (10 х 10 ⁶ клеток / 1 мл FACS окрашивания буфера), затем добавить FcR блокирующий реагент (20 мкл / 10 х 10 ⁶ клеток), аккуратно перемешать и место на льду в течение 10 мин.
3. Алиготе 100 мкл этой суспензии клеток в микро-центрифужные пробирки для каждого эндотелия поверхностного антигена и изотипа управления. Добавить соответствующее количество флуорохромом помечены человеческие моноклональные антитела, которые признают эндотелиальных антигенов (CD31, CD144, CD146, CD105 и) или гемопоэтических антигенов (CD45, CD14 и) и выйти на лед в течение 30 мин в защищенном от света. Внимание: 1 x 10 ⁶ клеток не требуется для каждого теста. Авторы обычно подготовить 0,5 до 1 x 10 ⁵ клеток / трубка для получения 2 х 10 ⁴ анализироватьг событий. Кроме того, следуйте рекомендациям изготовителя на сумму антител, которые будут использоваться для каждого теста. Некоторые антител может потребоваться титрование для определения оптимальной концентрации антител. Все окрашивания, что авторы провели одиночные окрашивании цвет.
4. После 30 мин инкубации на льду, центрифуги каждая трубка на высокой скорости на столе центрифуги в течение 5 минут, затем удалите супернатант и повторно приостанавливать осадок клеток в буфер FACS.
5. Анализ образцов на проточной цитометрии для определения процентного содержания клеток, что пятно положительно или отрицательно для каждого антигена. ECFCs пятно равномерно положительно для CD31, CD144, CD146 и, но негативный для CD45 и CD14 по сравнению с соответствующим контроль изотипа.
6. Для одного анализа клетки для изучения клонального пролиферативный потенциал, отделить ранний переход (2-3) клеток с TrypLE экспресс собирать клетки, используя методы, подобные той, что описана для ECFC клонирования и расширения.
7. Инфекция этих клетокс повышенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP), выражающая лентивирусов ¹⁶ и собирают клетки, экспрессирующие EGFP флуоресцентной цитометрии. Внимание: Работа с лентивирус считается биологически и все био-меры предосторожности необходимо соблюдать.
8. Культура их, как описано для культивирования ECFC в разделе ECFC расширения.
9. Подготовить Коллаген я покрытых 96-луночных добавлением 50 мкл крысы хвост коллагена типа I (50 мкг / мл) в каждую лунку и инкубировать пластины на ночь. Соберите EGFP ⁺ ECFCs с помощью экспресс-TrypLE и ресуспендируют их в EGM-2 среды с конечной концентрацией ~ 10 ⁶ клеток / мл.
10. Используйте FACS Vantage (Becton Dickson) или других аналогичных сортировщик с низким расходом 20 ячеек / сек для сортировки одного EGFP ⁺ ECFC в лунку 96-луночного планшета и настройки конечного объема до 200 мкл на лунку с EGM-2. Используйте перевернутой флуоресцентного микроскопа, чтобы каждый хорошо принята только одна ячейка. AlternativЭли, отдельные клетки могут быть отсортированы на основе FSC и SSC и Sytox ядерный краситель окрашивания колоний могут быть использованы для озвучивания клеток и количественного.
11. Инкубируйте планшет в течение двух недель с двумя изменениями среды (200 мкл EGM-2 с использованием многоканального pipetter) осуществляется на 5-й день и 10 день. На 14-й день культуры, мыть каждую лунку 100 мкл PBS до фиксации клеток с 100 мкл 4% параформальдегида в течение 30 мин. Для ECFCs, не выразив EGFP, добавить Sytox реагента, зеленого флуоресцентного красителя ядерной, после записи параформальдегид и инкубировать при температуре 4 ° С в течение ночи.
12. С помощью флуоресцентного микроскопа для изучения каждого и для количественного определения количества эндотелиальных клеток, которые расширили из одной клетки культивировали в течение 14 дней. Для количественного анализа, оценки скважин с 2 или более эндотелиальных клеток как положительным (для распространения), и рассматривать их в дальнейшем для общего количества клеток эндотелия путем визуального подсчета с флуоресцентного микроскопа.
13. Чтобы отобразитьон получил данные, колодцы с эндотелиальные клетки числа от 2 до 50, 51-2000, и 2001 и более, рассматриваются как эндотелиальные клетки кластеров, низкий пролиферативный потенциал (LPP) ECFCs и высокий пролиферативный потенциал (ГЭС) - ECFCs соответственно. ECFCs демонстрируют полную иерархию клоновых пролиферативный потенциал, что приводит к эндотелиальной кластеров, LPPs и ГЭС при культивировании на одном уровне клетки в течение 14 дней ^7.

С. В естественных условиях функциональная характеристика ECFCs: В естественных условиях Анализ формирования судна для изучения потенциальных ECFC для васкулогенез

1. Подготовить имплантатов cellularized гель расчета общего объема (мл) каждого из следующих материалов гель (с конечной концентрации в скобках), необходимых для приведения 1 мл геля (который будет позже пополам для получения 2-х имплантатах): ФПС (10 %), ДМ-2 10:1 (настройки конечного объема в 1 мл), бикарбонат натрия (1,5 мг / мл), NaOH (корректировать рН 7.4), HEPES (25 мм), fibronectiп (100 мкг / мл) и коллагена I (1,5 мг / мл).
2. После гель расчет материала, отделить клетки TrypLE экспресс собирать клетки, используя методы, подобные той, что описана для ECFC клонирования и расширения. Получить количества жизнеспособных клетки аликвоты помощью hemacytometer и трипанового синего. Передача 2400000 жизнеспособных клеток в 50 мл, коническая трубка и гранул клеток путем центрифугирования при 515 мкг, при комнатной температуре. Одновременно подготовить гель матрицы решения путем добавления рассчитаны объемы HEPES, бикарбонат натрия, ДМ-2 10:1, FBS, фибронектина и коллагена льдом 50 мл коническую трубку (в том же порядке, как они перечислены). Тщательно перемешайте и регулирования рН до 7,4 с NaOH, сохраняя при этом решение на льду.
3. Удалите супернатант из клеток после центрифугирования и повторно приостанавливать осадок в 360 мкл теплой EGM-2 и к нему добавить рН 840 мкл раствора гель матрицы, в результате чего конечный объем геля имплантат 1 мл. Смешать клеток в растворе матрицы геля медленно, покаКлетки полностью приостановлено в геле решение.
4. Передача этого 1 мл геля cellularized подвески одну лунку 12-луночного планшета для культуры ткани и инкубировать в течение 20-30 минут, пока гель полимеризуется. Осторожно покрытия гель с 2 мл теплой EGM-2 и инкубировать в течение ночи.
5. Непосредственно перед имплантацией, пополам ночной гель инкубировали на две равные части, используя диафрагмы ножницы и вернуться гель частей к той же культуре и содержащей EGM-2 средних.
6. Использование животных хирургическое средство успокоить животное (5-6 неделя NOD / SCID мышей) по администрированию ИФ анестезии. Бритье в нижней части живота и тщательно очистить места операции с алкоголем колодки и бетадин или другим антисептиком. Затем выделить область с драпировками, как в IACUC и институциональных принципов.
7. Использование стерильных острыми ножницами, чтобы диафрагма около 5 мм разрез в нижнем квадранте живота, обнажив пространства подкожной между кожей и брюшной мышцы. Выполните тупой диссекции через кожный слой брюшных мышц для создания 15-20 мм карман ведущих начальник в верхней части живота квадранта. Повторите аналогичную процедуру для создания подобных открытых кармана в другой стороне той же живот мыши.
8. Вставьте одну половину кусок геля в одну сторону брюшной карман, а другая половина кусок геля в другую сторону брюшной карман, поднимая слой кожи только в хвостовой разрез.
9. После введения геля, закройте каждый разрез с 2-3 стежками использованием полипропилена 5-0 шва на режущей иглой. Соответственно пометить клетку карты и выполнять послеоперационный контроль и обезболивания в соответствии с институциональными и требований протокола и позволяет в течение 14 дней клетки в этих имплантированных гели для создания заново сосудов.
10. Наконец, сбор гелем имплантаты, как правило, осуществляется через 14 дней после имплантации после эвтаназии мыши.
11. Тампон области живота с алкоголем колодки ирезать кожу с живота хвостовой к исходной линии разреза. Осторожно рассекают из имплантата путем вырезания лоскута кожи каудально вероятного местонахождения геля. Акцизные имплантата за счет сокращения окружности вокруг геля поместить в фиксирующий цинк (BD Biosciences, следуйте рекомендации производителя для достижения оптимального результата) и дать им возможность исправить в течение 1-2 часов при комнатной температуре.
12. Подготовьте парафин гелей с использованием стандартных протоколов гистохимических и подготовить 5 мкм разделы на стеклах выполнять окрашивание гематоксилином и эозином, анти-CD31 человека или анти-CD31 мыши, чтобы визуализировать сосудистую в гель. ECFCs пройти заново васкулогенез генерировать гуманизированные суда В cellularized гелем имплантаты вставляются в иммунодефицитных мышей в течение 14 дней ^4,8,11.

D. Результаты представитель

Используя эту технику ECFC вывод мы наблюдали из роста первичной форме колониирение, как уже в 5-й день (рис. 1). Из роста ECFC колонии выставлены типичный вид булыжника и привело к> 40 удвоений популяции на долгосрочное расширение после того, как колонии пикап путем клонирования. Расширение колоний выразил эндотелиальные антигены, но не выразить гемопоэтических антигенов (рис. 2). Важно, что они проявили полную иерархию клоновых пролиферативный потенциал на одном уровне клетки (рис. 3). Кроме того, формируется ECFCs гуманизированные кровеносные сосуды, которые перфузии с принимающими эритроцитов при имплантации в иммунодефицитных мышей ^{4, 6, 8, 11} (рис. 4).

Рисунок 1. Выделение мононуклеарных клеток (МНК) из пуповинной крови и результат эндотелиальных клеток, образующих колонии (ECFCs) из культивируемых МНК. МНК форму слой покрытия Баффи во Ficoll-Pague градиента плотности разделения клеток пуповинной крови. Выделение слоя покрытия Баффи культуре МНК на крысе хвост коллагена I покрытием результаты пластин следствием ECFC колонии от 5 до 14 дней. Колония результат ECFC (указано наконечники стрел), представленные булыжник морфологии ^7.

Рисунок 2. Представитель в пробирке фенотипическая оценки эндотелиальных и гемопоэтических выражение поверхностного антигена. Иммунофенотипирования пуповинной крови производных ECFCs показали, что ECFCs выразил эндотелиальные антигены CD31, CD34, CD144, CD146, Flt-1, FLK-1, Flt-4, но Nrp2 не выразить гемопоэтических антигенов CD45, CD14, CD11b, cKit, CXCR4 или AC133 ^{7, 8.}

Рисунок 3. Представитель в пробирке количественного клоны и пролиферативный потенциал ЦБ, полученные ECFCs. (A) пуповинной крови, Полученных ECFCs отображения клонального пролиферативный потенциал с иерархией колоний от скопления 2-50 клеток до колонии> 2001 года. (B) Микрофотографии иерархии колонии (колонии окрашивали, Sytox, зеленого флуоресцентного красителя ядерной взять лучшее качество картинки), полученные после пуповинной крови, полученных ECFCs культивировали на одном уровне клетки в течение 14 дней. Масштаб бара составляет ⁷ 100 ^{мкм, 8.}

Рисунок 4. Представитель в естественных функциональных характеристик пуповинной крови производных ECFCs. A) H & E окрашивания пуповинной крови, полученных ECFC содержащие имплантатов cellularized гель указано микрососудов (заполняется с принимающими эритроцитов) образование коллагена, фибронектина гель после 14 дней с момента имплантации. B) Anti-CD31 человека окрашивание (окрашивание коричневый) еще раз подтверждает человеческое происхождение этих судов.

Фенотипические и функциональные характеристики предполагаемого эндотелиальных клеток-предшественников, важно определить добросовестных ECFCs, которые способны клонировании и серийно повторное покрытие в области культуры и привести к прочным и функциональным имплантируемых кровеносных сосудов в естественных условиях. Человека пуповинной крови обогащается ECFCs и концентрация этих циркулирующих клеток снижается с возрастом или болезнью ^10. Последние исследования показывают, что ECFC может играть важную роль в сосудистых ремонта или восстановления в условиях повреждения сосудов, инфаркт миокарда, или ретинопатии ^17-19.

Здесь мы описали простой и эффективной методики для вывода, клонирования, расширение, и в пробирке, а также в естественных условиях характеристики ECFCs из человеческой пуповины ЦБ. Эти подходы позволяют исследователям идентифицировать и изолировать добросовестных ЕРС от ЦБ, которые обладают клонального пролиферативный потенциал и В естественных условиях судно формирование способности.

Нет конфликта интересов объявлены.

Доктор Yoder является консультантом EndGenitor Technologies, Inc и член совета Rimedion Technologies, Inc