Крупномасштабные Запись нейронов Зонды Движимое кремния в Поведение грызунов

Мы опишем методы для крупномасштабного запись нескольких отдельных единиц и местного потенциала поля в себя грызунов кремниевых зондов. Drive производства, зонд вложений на диск и процесс имплантации датчика показаны на достаточно подробно для легкого тиражирования.

Одна из основных задач в области неврологии связывает поведение в коллективной деятельности нейронных сборки. Понимание ввода-вывода отношений нейронов и схемы требует методы пространственной избирательности и временное разрешение подходит для механистического анализа нейронных ансамблей в себя животных, то есть запись представительно больших образцов изолированных отдельных нейронов. Ансамбль мониторинг активности нейронов шло замечательно в последнее десятилетие в больших и малых мозгом животных, включая человека в качестве субъекта ^1-11. Несколько месте записи с устройств на основе кремния особенно эффективны, потому что их масштабируемость, малый объем и геометрические конструкции.

Здесь мы опишем методы для записи нескольких отдельных нейронов и местный потенциал поля в себя грызунов, используя коммерчески доступные микро-обработанной зондов кремния с заказной компонент аксессуаров. Есть два основных варианта Fили взаимодействия кремниевых зондов для предусилителей: печатных плат и гибких кабелей. Зонд компаний-поставщиков ( http://www.neuronexustech.com/ ; http://www.sbmicrosystems.com/ ; http://www.acreo.se/ ) обычно предоставляют услуги связи и доставить зонды связаны с печатных плат или гибкие кабели. Здесь мы описываем имплантации 4-хвостовик, 32-сайт зонда прикреплены к гибкой полиимида кабель и установлены на подвижных Microdrive. Каждый шаг зонда подготовки, Microdrive, строительство и операции проиллюстрирован таким образом, что конечный пользователь может легко повторить этот процесс.

1. Строительство Microdrive

Все диски изготавливаются из тех же основных элементов: подвижная часть, которая несет в себе электрод и фиксированная часть, которая крепится к черепу. Идеальный Microdrive позволяет гладко, но достаточно долго, путешествия электрода в несколько небольших шагов, достаточно прочен, чтобы предотвратить случайное движение электрода, легко манипулировать со стороны экспериментатора, не вмешиваясь в поведение животного, небольшие размеры и легкий вес. В результате этих противоречивых требований различных набор дисков различных приложений.

Только 4 части, необходимые для создания нашего основного диска: медь плоскую головку винта, соответствующие гайки, пластиковые моста получают из одного штырьками строки и два пользовательских огранки пластин латуни.

1. Перерыв 3-контактный кусок из заголовка
2. Аккуратно вытащите центральный контакт.
3. Увеличить отверстия путем бурения через него с размером сверла № 55.
4. Вырезать-йчитать с помощью крана 00-90.
5. Вырежьте две части из латуни пластины.
6. Файл края пластины с Dremmel.
7. Просверлите отверстие в середине, как части, используя размер сверло # 65.
8. Установите диск куски так, что медные листы касаются контактов. Для этого вставьте медный винт через последовательно латунные пластины, резьбовое отверстие штырьками, вторая пластинка меди и гайки. Затяните винт мягко так, что сборка становится стабильной.
9. Припой вывода концов медные листы.
10. Файл выступающий конец винта.
11. Припой гайку с винтом. Будьте осторожны, не припой гайки латунные пластины.
12. Проверьте движение диска: повернуть винт по часовой стрелке, чтобы поднять пластиковую моста.

2. Подготовка зонда кремния

Перед установкой датчика на диск, добавить дополнительную изоляцию в области связи зонда для предотвращения cerebrospinal жидкости (ликвора) или влажности от производства коротких замыканий:

1. Взвешивание и смешивание компонентов Sylgard эластомера в соотношении 10:1.
2. Использование заостренным аппликатором хлопка, применяются Sylgard в верхней части зонда.
3. Дайте ему высохнуть в духовку нагревают при температуре 60 ° С в течение 2 часов.

Чтобы гарантировать, что записи сайтов лишены любого мусора, зонд советы должны быть очищены:

4. Подготовьте 4% разбавления Contrad моющего средства.
5. Пусть зонд замочить в моющих средств на 63 ° C в течение 2 часов.
6. Промойте чистящее средство путем погружения зонда неоднократно в дистиллированной воде.

Перед установкой датчика на диске, сопротивление каждой записи сайта должны быть проверены:

7. Опустите зонд в 0,9% раствор, и подключить его к импеданс-метра. Если слишком много сайтов записи имеют неправильное сопротивление, повторите шаги 2.4-2.6 или рассмотреть возможность использования различных зонда.Здесь мы используем сопротивление модуля кондиционирования с Фредериком Haer, Co (ФЭК) в сочетании с домашним селектора каналов. Кроме того, по niPOD NeuroNexus, Inc или NanoZ по Neuralynx, Inc позволяет контролировать сопротивление всех зонд каналов одновременно.

3. Нанесение зонда Microdrive

1. С помощью лезвия, нарезать канавки в нескольких мостов для создания прочной поверхности.
2. Сопоставлять зонд к мосту привода. Эта процедура лучше всего делать под операционным микроскопом, держа диск с зажимом и настройки датчика по микроманипулятор чтобы черенки отлично параллельно с диска винта. Это гарантирует, что во время продвижения по службе, движение зонда черенками в ткани головного мозга без «резки» через него. Точная глубина зонд советы относительно базового привода должна быть определена на данном этапе, принимая во внимание глубину целевой структуры с поверхностичереп.
3. Зонд затем крепится к мосту с зажимом цемента.
4. Дополнительно: для визуализации зонда след в мозгу, DiI раствор (1-2% растворяется в этаноле) могут быть применены к задней части датчика на данном этапе.

4. Подготовка черепа

До операции, ссылка и наземных электродов и частей на голове клетки Фарадея готовы:

1. Отрежьте два 2 "длинные куски медной проволоки, и припаять один конец каждой изолированной медной проволоки около 1 мм.
2. С помощью иглы, очистить голову от 00-90, 1/8 "винтом из нержавеющей стали и припаять один кусок медного провода к нему. Пайка таких нержавеющая сталь винт заземления, электроды требует соответствующего потока (например, N-3 Универсальный Поток из Ла-Co) и высокой температуры пайки чаевые. Тщательно предотвращения припой из впадающих в паз винта. Это будет использоваться как основание электрода. Повторите с другой винт и медной проволоки, чтобы подготовитьэлектрода сравнения.
3. Вырезать trapeziodal отрывки из медной сетки. Эти части будут собраны для защиты headstage.

Хирургические инструменты и подготовки такие же, как используется во многих небольших операций животным. Вся операция проводится под наркозом глубоко ИФ с использованием асептических условиях, в соответствии с НИЗ утвержденных принципов. Пожалуйста, обратите внимание, что (макет), операции показаны в этом видео только для демонстрационных целей. Для соответствующих целей и видимость съемки, несколько подготовительных шагов, хирургические меры предосторожности и послеоперационные процедуры не показаны / видимыми или обсуждается.

До операции, все компоненты и материалы должны быть стерилизованы, после соответствующих процедур (см. Руководство по выживанию хирургии грызунов; http://oacu.od.nih.gov/ARAC/surguide.pdf). Во время операции, стерильные поля на череп подготовлены и выделены стерильной драпировки. В конце операции, антибиотики широкого спектраpplied локально, так и длительного действия боль убийца внутримышечно (например, бупренорфин, [Buprenex] 0,05 мг / кг). Кроме того, обезболивающее (например, ибупрофен) содержится в питьевой воде около 60 часов mg/kg/24 течение 5 дней. Для правильной хирургической анестезии и процедуры, проконсультироваться с соответствующими источниками ^12.

4. Установить животных в стереотаксического аппарата, бриться и чистить кожу головы ^13.
5. Разрежьте кожу вдоль средней линии и отодвинуть кожу головы. Удаление надкостницы, чистой и сухой череп.
6. Измерьте местоположение и расстояние между брегмы и лямбда, и определить координаты х и у участка имплантации датчика соответственно помощью стереотаксической атлас ^14. Отметьте место, очищая крест на черепе с помощью скальпеля.
7. Просверлите черепа с помощью круглой сверло головы (размером ¼) и винты диска поддержки (из нержавеющей стали, 000-120, 1/16 ") на полпути в кости, на разных пластинах кости на вершинея на стороне черепа. Винты обеспечит якорей безопасно связь головной убор к черепу.
8. Просверлите отверстия над мозжечком и вставить землю и электродов, подготовленный в шаге 4.2. Для регистрации локальных потенциалов поля (LFP), выбор сайта ссылка имеет решающее значение. Этот сайт выбрана потому, что мозжечковая LFP является самым маленьким из всех областях коры и мышечных артефактов минимально возможным на этом месте средней линии.
9. Применение дентина активатора (Metabond комплект) с помощью крошечной кистью по всей поверхности черепа. Промойте его с 0,9% раствором.
10. Применение стоматологического цемента (Metabond комплект, следуйте инструкциям производителя для смешивания) на черепе, тщательно покрытие анкерные болты и землю и электродов, но оставляя места имплантации датчика ясно.
11. Закрепите четыре медные сетки закрылки (подготовлен в шаге 4.3) к черепу. Для этого цемента узкая база каждого из них на передней, левой, правой и задней сторонах черепа. Thэлектронной медь никогда не должны находиться в прямом контакте с костью, но всегда, разделенных слоем цемента.

5. Подготовка поверхности мозга

1. С помощью круглого сверла голову, сверлить вокруг места имплантации в несколько этапов, в то время часто орошения кости с физиологическим раствором.
2. Осторожно снимите костный лоскут и орошать поверхность мозга.
3. Для установки нескольких голени зонд, большая полоса оболочки удаляется. Два инструмента, необходимого для удаления оболочки: скальпель и крюк получают из насекомых иглы (в качестве альтернативы стандартным микроэлектрода вольфрама). Согните кончике иглы, нажав на твердую поверхность (например, предметное стекло стекло), и приложите его к ручке (здесь, кусок деревянного Q-Tip, наоборот microdissecting иглодержатель).
4. Снимите оболочку с крюка, и резать скальпелем. Особое внимание уделяется, чтобы избежать повреждения мягкой, сосудов и поверхности коры головного мозга. Малые кровотечения могут быть решенысоленой орошения. Если кровотечение происходит или коры головного мозга находится под угрозой в любом случае, следует учитывать прекращение операции и подготовку другого животного.

6. Имплантация зонда

На данном этапе, плотность и ориентация коры надводных кораблей тщательно оценены. Стереотаксических координат должны быть скорректированы, так как зонд должен проникнуть в мозг, в зону, свободную от более крупных судов.

Для имплантации, привод сборки могут быть проведены с крокодил прикреплены к стереотаксической владельца. Бесперебойное видимости поверхности мозга и советы зонда имеют решающее значение для успешного проникновения.

1. Медленно опустите зонд до примерно 1 мм выше намеченной цели, постоянно орошения трепанация черепа с физиологическим раствором. Для записи неокортекса, зонд советы опускается в коре примерно 0,5 мм и подняли обратно на поверхности.
2. Печать трепанация черепа, применяя теплую расплавленную смесь масла воска и парафина с помощью иглы (10-20г воска в 10 мл парафинового масла, нагревают до 65 ° C). Перед нанесением охладить смесь до 30 ° C и проверить плотность. Он должен быть достаточно мягким, чтобы облегчить движение зонда). Для облегчения полного охвата, смесь может быть расплавлен на месте, приближаясь к закаленные воск кончиком микро-cauterizer.
3. Прикрепите нижнюю часть диска черепа с рукояткой цемент, будьте осторожны, чтобы оставить гайка свободно вращаться. Это крайне важно, чтобы избежать случайного "поднять" привода на данном этапе, в противном случае датчик может привести к повреждению мозга. После того, как диск крепится к черепу, плавное движение зонда должна быть проверена.
4. Цемент разъем части зонда к черепу.

7. Создание на голове клетки Фарадея

1. Потяните вверх и собрать закрылки медной сетки в защитный цилиндр вокруг зонда и DRIве. Цилиндра и служит электрический щит от внешних шумов и артефактов, медленно волны, создаваемой заряженными усы в себя животных.
2. Отрегулируйте высоту цилиндра срезая излишки материала, поэтому медные сетки на одном уровне с верхней части датчика разъем.
3. Припаяйте провода от ведения и землю винты в соответствующие контакты разъема. Кроме пайка соседних закрылки сетки меди вместе, чтобы обеспечить их непрерывность электрической цепи, и припаять провод заземления к медной сетки.
4. Нанесите слой сцепления цемента на медной сетки укрепить его и не допустить прямого контакта между металлом и кожей животного. По желанию, нанесите слой эпоксидной смолы для дальнейшего укрепления головные уборы.
5. Проверьте движение ходовой винт.
6. Крышка в верхней части головного убора с частью вырезанные из резиновых перчаток.

8. Запись в свободно движущихся животных

1. После того, как соотели послеоперационного ухода, подключить животных к записи системы с использованием высоких headstage сопротивление и легкие, ультрапластичным многожильного кабеля. Противовес весом головные уборы.
2. Проверьте качество записи каждый день в homecage. Положение записи сайтов судят как единица стрельбы узоры и формы местного потенциала области. Опустите зонд постепенно, поворачивая винт небольшими порциями (обычно 1/8 до 1/4 оборота в день, т.е. 35-70 мкм) до целевой структуры будет достигнуто.

9. Представитель Результаты

Электрофизиологические сигналов (локальный потенциал поля и блок деятельности) зависит от структуры и записано текущее поведение животного. На рисунке 1 показаны примеры 32-канальный СА1 гиппокампа записи в то время как крыса изучает открытое поле. Обратите внимание на выдающийся 8 Гц (тета-диапазоне) колебаний локальный потенциал поля при исследовании с вирerimposed пики на несколько черенков и объектов (примеры шипами указывают стрелки). Для анализа активности нейронов устройство, шипы обнаружены и сортируются в единичных экземплярах с использованием кластерного анализа их сигналов ^15-16.

Рисунок 1. СА1 гиппокампа записей в себя крыс с помощью 4 х 8 черенки сайтов кремния зонда. Аудиозаписи широкополосных и дискретизации 20 000 Гц, что позволяет изучать как локальное поле потенциальных колебаний (например, "тета" группа 8 Гц ритм) и пики активности нейронов.

Таблица 1. Альтернативы реактивов и оборудования.

Этот фильм иллюстрирует имплантации кремния зонды для хронических крупномасштабных записей в себя крысой. Критические шаги по обеспечению качества записи активности нейронов возникают хрупкость и биологические (мозговой ткани) и технические (кремний зонд) материалов. Особое внимание должно быть принято при работе с зондом, чтобы избежать любого контакта с хвостовиком любого удаленного "жестких" поверхность (например, черенки, нарушит, если пытались имплантировать их в мозг, не удаляя оболочку). Кроме того, любое повреждение ткани головного мозга (при подготовке поверхности мозга для имплантации, или натыкаясь на зонд или диск, когда он будет имплантирован) может привести к повреждению клеток и ставит под угрозу запись единицы деятельности. Кроме того, электрический путь заземления должны быть проверены, так как любая схема прерывания между спинномозговой жидкости, винт заземления, медной проволоки, закрылки медной сетки и заземление в Connectoг, приведет к большим артефактов движения и / или линии шума (50 Гц или 60 Гц). Если клетка Фарадея не достаточно высок, выступающие микро-диск может выступать в качестве антенны. Антенный эффект можно предотвратить с помощью заземления привода, а также (припой другой медного провода между приводом и медно-сетка). Путь опорного сигнала должно быть так же проверяется.

Мы проиллюстрировали имплантации одного датчика кремния, но несколько записей сайта с помощью нескольких датчиков и приводов может быть легко достигнуто после некоторой практики. Кроме того, мы используем аналогичные, но меньшие диски для имплантации кремния датчиков в мозг мыши. Коммерчески доступных кремниевых зондов и зондов-гибкий кабель-разъем компонентов, а также небольшой размер многоканальных предусилителей резко упростить процесс подготовки по сравнению с предыдущими методами. Сегодня это так легко записать от 64 до 128 сайтов одновременно в себя грызуном со 2 сайтовпроволочных электродов всего десять лет назад.

Кремний зонд технология переживает бурное развитие и широкое использование ^17. Предусилители могут быть интегрированы с датчиками ¹⁸ и меньше headstages, мультиплексоры и телеметрических систем изготавливаются в промышленных масштабах, расширить пределы физиологических записи дальнейшего ограничения.

Последние теоретические и экспериментальные исследования с кремниевых зондов ^17,19 показывают, что при правильной изысканный крупномасштабные методы записи, в ​​сочетании с новыми идеями и математическим моделированием исследований, можно будет записывать с представительно большая часть или, возможно, каждый нейрон от объема мозга опрошенных нескольких хвостовик кремния зонда (тысячи клеток в ~ 1 мкм ^{3, 5-17).} Однако, учитывая корреляционный характер этих измерений, причинно-следственных связей между нейронной модели деятельности остается неизбежно неоднозначно. Глубокое пониманиекак скоординированную деятельность ансамбля выходит из его компонентов нейронов требует как минимум двух дополнительных шагов. Первый из них является определение нескольких типов клеток, нейронов, каждый из которых однозначно способствует сборке поведение - в буквальном смысле, как члены оркестра. Второе, и дополнительных шага, является принципиальным манипуляции пики активности выявленных клетки или группы клеток, таким образом, инженеры допросить электронных схем ^20. Недавно разработанных молекулярных инструментов optogenetic могут быть использованы для управления конкретной популяции клеток местной световой стимуляции ^20-22. Эффективное сочетание большого масштаба и записи оптических методов с кремниевых зондов ²³ предусматривает средства для определения и выборочно вождения конкретных популяций клеток, поэтому позволяет обратиться к причинно-следственных связей в мозге сети.

Нет конфликта интересов объявлены.

Marie Curie International Исходящие стипендий (Европейского союза FP/2007-2013 грантовых соглашений # 221834 и 254780), JD McDonnell Foundation, NSF гранта SBE 0542013, Национальные институты здравоохранения Грант NS034994, Национальный институт психического здоровья Грант MH5467 и Медицинского института Говарда Хьюза (Janelia Ферма Исследование Campus гранта).