Видео-курс сканирующей конфокальной микроскопии и Microendoscopy

Завершить строительство обычаю, в режиме реального времени конфокальной сканирующей системы визуализации описано. Эта система, которая может быть легко использован для видео-курс микроскопии и microendoscopy, позволяет массив визуализации геометрии и приложений, не доступными с использованием стандартных коммерческих конфокальной системы, на долю от стоимости.

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets¹, monitor dynamics in living cells^2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms^5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo⁷ and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings^8,9.

Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.

Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole¹, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.

Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.

In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

Выбор длины волны лазерного излучения, дихроичных зеркал и оптических фильтров должна быть определена на основе конкретных красителей, используемых в эксперименте. Например, конфокальной микроскопии образца окрашенных Alexa Fluor 488 лучше всего достигается использованием 488 нм лазер, 500 нм длинный проход дихроичным зеркалом, и 30 нм пропускной полосы пропускания зеркала с центром в точке 515 нм. В отличие от конфокальной микроскопии красного красителя Alexa Fluor 647 потребуется различный набор компонентов. Микроскопом в этом протоколе была построена для визуализации любой краситель, который сильно поглощает при 400 нм и излучает за 450 нм. Поэтому мы решили возбуждения 406 нм и 425 нм длинный проход дихроичных для отражения лазерного луча. Возбужденные флуорофоров могут быть выборочно себе, выбрав соответствующие фильтры выбросов. Важно использовать правильный оптический монтаж оборудования в той же протокол, в котором указано, неправильное или временных оборудование не будет проводить выравнивание, а также и может представлять опасность.

Важным понятием в строительстве любых конфокальной системы сканирования telecentricity. В телецентрической оптической системы, линзы расположены на расстоянии друг от друга по сумме их фокусных расстояний, например, что увеличение системы просто определяется отношением фокусного расстояния ^1. Это позволяет построить оптическую систему реле, где увеличениях, и таким образом системные свойства, легко определяется выбором объективов. Еще одно важное понятие включает в себя так называемые «стационарные» оптических плоскостей, называемых также "отверстие самолетов". Диафрагмы плоскости положение вдоль оптического пути, где луч света не подвергается любой боковое движение. В этом микроскопе дизайн Существуют три важных плоскости диафрагмы: первый и второй сканирования зеркала и обратно апертурой объектива. Для достижения оптимального луч SCAnning в фокальной плоскости объектива, луч входе обратно апертура объектива должен быть неподвижен, подметание только в угол. Для того, чтобы создать этот стационарный, угол стреловидности самолет, нам нужно место первого и второго сканирования зеркалами на сопряжены, телецентрической самолетов на цель резервного диафрагмы. Линзы помещают между зеркалами и объектива служит для передачи отсканированных угла луч между этими неподвижными плоскостями (рис. 2). Сканирования зеркала смонтированы на двух сканирования galvos, каждый из которых отвечает за сканирование заданного направления плоскости изображения (X и Y). Для получения требуемой скорости сканирования линии для видео-курс изображений, высокочастотные резонансные galvo требуется для сканирования оси Х (также известный как "быстрый" оси). Эти galvos использовать чувствительный, замкнутой обратной связью схему для создания синусоидального шаблон сканирования и способны работать на очень высоких частотах, мы выбрали 8 кГц galvo для этой сборки.

1. Создаватьволокна коллиматор в оптическом гору и примерно направить пучка с помощью регулировочных винтов, что он проходит по прямой линии по горизонтали и по вертикали. Теперь возьмите диафрагмы и поместите его перед коллиматором волокна, регулируя высоту вертикальной диафрагмой, такие, что луч проходит через чисто диафрагмы центра. Затем, перейдите диафрагмы от коллиматора по ходу луча и наблюдать, если луч все еще проходит через диафрагму центра. Если нет, то корректировать положения пучка на радужной оболочке с помощью двух винтов регулировки.
2. Место установлен дихроичных зеркал в пути пучка с лазерным лучом расположена примерно в центре зеркала. Перед зажима зеркало на стол, повернуть зеркало Держатель для отражения луча на примерно 90 градусов и примерно настроить так, чтобы отражение вертикальной высоты отраженного лазерного луча не меняется.
3. Место установлен резонансный гальванометрические зеркало на пути лазерного луча, принимая автомобильэлектронная, чтобы лазерный луч находится точно в горизонтальной центр зеркальной поверхности. В этом протоколе резонансных зеркало galvo был expoxied прямо на зеркало монтирования. Поверните зеркало крепление для отражения лазерного луча на 90-градусный угол. Грубо настроить отражения от зеркала, чтобы сохранить тот же лазерный луч вертикальной высоты.
4. Для того, чтобы направлять любые луч света в данном направлении, необходимо, по определению, определить две точки в пространстве, через которое луч будет путешествовать. Обычно это достигается путем размещения двух ирисов вдоль желаемой горизонтальной и вертикальной траектории и управления лазерным лучом, чтобы пройти через центр каждой радужной оболочки. Четыре степени свободы необходимо корректировать луч, два горизонтальных и вертикальных степеней свободы для каждой диафрагмы. Наиболее распространенный и простой способ для достижения этих степеней свободы заключается в использовании двух зеркал управлять, или "ходить", лазерный луч.
   Возьмите два ирисы, и установить их высоты, какв пункте 1.1, использование лазерного луча, отраженного от зеркала резонансных galvo в качестве эталона. Теперь, используя отверстия на оптических макет в качестве руководства для глаз, зажим два ирисы вниз по прямой линии.
5. Отрегулируйте дихроичных зеркал и резонансных зеркало galvo направить лазерный луч через центр две ирисов. Используйте первое зеркало в пути (дихроичных зеркал) к центру луча на первую диафрагму, затем с помощью второго зеркала в пути (резонансное зеркало galvo) к центру луча на второй диафрагмы. Итеративно настроить эти два зеркала, пока луч выравнивается через обе ирисы, обеспечение всем, что лазерный луч, отраженный от зеркала резонансных galvo до сих пор, отраженный от приблизительно в центре зеркала. Если луч отклонился, отрегулировать крепление волокна коллиматора и повторять итерационные шаги выше.
6. С луч в центре по обе ирисы, мы сейчас место два релейных линзы, которые будут изображения наш первый стационарный, телецентрической плане (т. е. резонансное зеркало galvo) на наш второй стационарный, телецентрической плоскости (например, стандартная скорость galvo зеркало). В данном конкретном микроскоп, выбранные линзы в первую реле имеют одинаковое фокусное расстояние, "е", так что расстояние между двумя зеркалами в нашей телецентрической система просто 4f. Для того, чтобы линзы точно по центру луча, использовать трюк линзы выравнивания. Место первой линзы в пути луча и посмотреть на месте лазерного луча на радужной оболочке следующим в пути луча следующие линзы. Далее, регулировать высоту линзы вертикально так, чтобы вертикальный обрабатывающий центр пучка на диафрагму центра. Наконец, отрегулируйте горизонтальное положение луча центра луча на радужной оболочке. Провести эту же процедуру для второй линзы.

2. Установка второго зеркала сканирования и вращающихся микроскопом

1. Чтобы найти точное положение второй самолет телецентрической, подключить к резонансным galvoего сканировании устройство и включите его. Используйте белую визитную карточку для отслеживания сканирования пучка через две линзы. Вы найдете телецентрической плоскости в расстоянии приблизительно в 4f из резонансных galvo, где лазерный луч будет появляться совершенно неподвижным. Отметить этот позицию на макетной плате.
2. Установите стандартный сканирования galvo зеркало на этом точное местоположение телецентрической плоскости и регулировать высоту и положение зеркала так, чтобы луч на плоскости телецентрической удары точно в центре сканирующего зеркала. Крайне важно, чтобы питание аппаратных зеркало контроль и положить напряжением 0 вольт на сканирующее зеркало вход, так что зеркало располагается в нейтральное положение во время этого процесса. Тщательно настроить зеркало углом к ​​прямой луч вертикально и аккуратно затяните зеркало в нужном положении.
3. Как мы строим прямой микроскоп, мы теперь придаем второй макет на 90 градусов с использованием 90 градусов монтажными кронштейнами. Убедитесь в том, чтобы выключитьлазерное сканирование и электроники, отключите волокна, и отключить сканирование зеркала во время этого процесса. Для того, чтобы остальные выравнивание легче, когда-то скобки болтами на место, осторожно поверните весь микроскоп, так что новый макет теперь лежа. Использование зажима для фиксации макет к рабочей поверхности. Теперь оставшаяся часть ранее вертикальной установки может быть легко осуществляется на плоской макетной плате.

3. Настройка сканирования, трубки и объективы

Далее мы создали второй набор реле линзы, официально называется "сканирование линзы» и «трубки линзы". Важно выбрать правильное сочетание линз с тем чтобы добиться правильного увеличение на цель фокус и оптимизации окончательного разрешения изображения. Во-первых, для достижения максимальной числовой апертурой (NA) того или иного объектива, лазерного луча, падающего на задней цель должна заполнитьназад диафрагма полностью, только тогда будет объектив смогут создавать сжатые фокус. Объективы имеют диапазон размеров диафрагмы обратно; выбрал коэффициент увеличения линзы немного переполнения обратно отверстие выбранной цели. Во-вторых, для того, чтобы добиться права увеличением, объектив должен быть согласован с трубкой фокусное расстояние объектива, для которых она была разработана. К сожалению, разные производители микрообъектива решили использовать различные трубки линзы фокусное расстояние, поэтому очень важно создать микроскоп с правильным объектив трубы для конкретного объектива работу. Кроме того, некоторые производители, такие как Zeiss, линзы разрабатывать свои трубки для компенсации хроматических аберраций конкретные их соответствие цели, такие, что использование неправильного объективно-трубки линзы пара будет на самом деле внедрения новых аберрации, которые иначе не могли бы присутствовать. Как правило, мы предпочитаем Olympus целей, так как все хроматические компенсации осуществляется в гоэлектронной сама цель, что делает задачу / трубка линзы сопряжения проще. Хотя микроскоп все равно будет работать, если объективно и трубки линз не совпадают, фактическое увеличение микроскопа, скорее всего, не совпадают с увеличением котируются на объектив. В данном конкретном микроскопом строить, оптимальный размер диафрагмы обратно была определена в 4 мм, что требует увеличения соотношении 1:4 между объективом сканирования и трубки объектива. Для этого обычая микроскопом строить, мы будем использовать сканирование фокусного расстояния 75 мм и длиной трубки объектив 300 мм.

1. Как общее расстояние между второе зеркало сканирования и объективного внимания велико, этот сегмент микроскопом сборки будет первой раскладке зеркал необходимо направить луч на объектив. Место первого крупного, 2 "(50 мм) диаметром зеркала близко к краю платы, и поворачивать зеркало крепление для отражения лазерного луча около 90 градусов. Грубо настроить отражения от зеркала, чтобы сохранить тот же вертикальный BEAм высоты. Место другие 2 "зеркало на противоположном краю макета в ориентации, которая направляет пучок вниз под углом 90 градусов. Используйте регулировочные винты для обеспечения вертикальной высоты пучка не меняется. Установите два ирисы, как в пункте 1.4, и настроить два зеркала, как указано в шаге от 1,5 до центра пучка на ирисов.
2. С ирисы-прежнему на месте, места сканирования линзы в пути луча и отрегулировать его горизонтальное и вертикальное положение для центра лазерного пятна на первой диафрагмы. На расстоянии 75 мм + 300 мм от линзы (между двух зеркал), тщательно место большим 2 "трубка объектива и отрегулировать его горизонтальное и вертикальное положение к центру луча на первой диафрагмы. В целях поддержания выравнивание в будущем, полезно оставить эти ирисы на месте, для этого приложения, визитную карточку с соответствующего размера отверстия может быть приклеен к стоять и вставлены в луча.
3. При всех зеркал и линзСейчас на месте, начать сканирование резонансных зеркало galvo и стандартное большое зеркало сканирования. В этой сборке, стандартное большое зеркало сканирования в конечном итоге будут синхронизироваться с Скорость сканирования резонансного зеркала, через заказные схемы управления, такие, как описанный на рисунке 3, что обеспечивает превосходную вертикальной и горизонтальной синхронизации. Однако, для целей выравнивания и многих приложений обработки изображений, зеркало могут быть легко сканировать с помощью шаблона из пилообразной функции генератора. Использование визитной карточки найдите лазерный луч на позиции 300 мм после трубки объектива. Хотя луч сканирует в других местах в микроскоп и в вертикальном и горизонтальном направлениях, луч должен быть совершенно стационарных вблизи этого места. Здесь назад отверстие объектива будет размещен. Если горизонтальные и вертикальные стационарные самолеты не совпадают в одной плоскости вдоль пути луча, осторожно разжимать и перевести трубки линзы вдоль оптического пути, чтобыобеих плоскостях перекрытия настолько близко, насколько это возможно. Re-центр вертикального и горизонтального положения трубки объектива и зажмите его надежно на месте.
4. Место объектива в пути луча, убедившись, что положение объектива обратно отверстие как можно ближе к неподвижной плоскости, как это возможно. Истинно диафрагмы обратно цель не может фактически быть всегда находится на физическом открытия задней цель из-за различной выбор производителя дизайном. Поэтому всегда лучше, обратитесь к производителю, чтобы определить истинное положение диафрагмы обратно.
5. Настройка предметный столик, убедившись, что перевод гору, которая позволит оси движения могут перемещаться по всей ее диапазон, не сталкиваясь с целью креплением.

4. Настройка и согласование конфокальной обскуры и детектор

1. Отключите все источники питания и волоконной оптики, и поверните микроскопом сборки такова, что она снова лежит на плате холдинга резонансрезонансные сканирующего зеркала. Зажим макет надежно в месте, а затем вновь подключить волокна коллиматор, и повторно подключить оба galvos и кабелей управления. Как и прежде, место 0 вольт на управляющее напряжение вождения стандартного сканирования galvo.
2. На предметный столик, место визитную карточку или малого объема яркие краски в цель фокус, зажатой между двумя покровные. Выбор красителя зависит от лазера и дихроичных выбран, в этом случае мы будем использовать флуоресценцию излучением белого визитную карточку для выравнивания конфокальной системы обнаружения. Квантовые точки могут быть полезны для выравнивания целей, так как они являются ярким и не photobleach. Другие варианты включают флуоресцентные бусы и / или образцы ткани подвергаются цвет / прачечная отбеливатель, оба из которых светиться ярко. Включите лазерный источник и принести образец в микроскоп фокус использованием перевод стадии. После того как в фокусе, флуоресценция генерируется из выборки должны быть видны за тон дихроичных зеркал, как описано в следующем шаге. Максимальная мощность лазера, чтобы сделать флуоресценции так ярко, как это возможно.
3. Использование визитных карточек, следов флуоресценции излучения образца через объектив и обратно через систему сканирования для дихроичных зеркал. Дихроичных зеркал будет передавать флуоресценции излучения, отражая луч лазера; найти эту флуоресцентного сигнала на другой стороне дихроичных зеркал. Теперь поместите зеркало позади дихроичных зеркал и использовать его для отражения излучения на 90-градусный угол. Возьмите ирис, как это было сделано в шаге 1.1, и использовать его вместе с зеркалом, чтобы направить луч флуоресценции как прямо и параллельно плате, насколько возможно. Этот шаг может быть лучше всего проводить в тусклом свете.
4. Настройка конфокальной блок отверстие, как указано на рис 2. Мы обнаружили, что пространственный фильтр клетке Узлы из ThorLabs идеально подходит для этой задачи. Важно, чтобы выбрать соответствующие pinholэлектронной размер, чтобы убедиться, что система конфокальной микроскопии достигает своего оптимального разрешения без ущерба слишком много сигналов. Для этого обычая микроскоп, отверстия размером 100 мкм был выбран. Место пространственного фильтра в соответствии с флуоресценции путь луча, заботясь, чтобы центр первой фокусирующей линзы устанавливаются на флуоресценцию луч выбросов. После монтажа коротких фокусным расстоянием в единицу (объектива микроскопа также может быть использован), слайд-г-перевод гору, пока четкой направленности можно наблюдать на поверхности отверстия. Убедитесь, что весь блок ориентирован по точным прямой установленных флуоресценции луча. Зажим блока к макетной плате.
   Выбросы от большинства образцов слабы по сравнению с уровнем внешней освещенности, даже в темных помещениях. Поэтому крайне важно, что адекватное экранирование / свет непонятно использоваться наряду выбросов путь для защиты от бродячих загрязнения света. Кроме того, высокие уровни окружающего света от перегрузки и повреждения многих ФЭУ, особенно тех, кто не сurrent защиты. Читатели, поэтому им настоятельно рекомендуется использовать объектив трубы вложить пути пучка излучения; экранированный система, как один показали здесь, способные работать в комнате свет с практически нет бродячих загрязнения света.
5. Теперь с помощью ручек настройки на этапе трансляции, систематически двигаться конфокальной отверстие, чтобы найти точку, где флуоресцентного сигнала через отверстие достигает максимального уровня. Эта позиция наиболее легко, выявленных в ходе итерационного корректировка двух осей для выполнения 2D поиск в поверхностного монтажа отверстие. Как только сигнал максимально позиция найдена, место коллимирующей линзы на клетку гору после обскуры. Найти флуоресценции излучения, проходящего через устройства с помощью конфокальной визитную карточку, и слайд-коллимирующей линзы вдоль должностях до излучаемого сигнала флуоресценции так же коллимированного насколько это возможно. Как только луч коллимируется, не забудьте поставить соответствующий фильтр на пути пучка в линзе ваннойe.
6. Настройка фотоумножителя (ФЭУ) сборки. Место 50 мм фокусным расстоянием в флуоресценции пути пучка излучения и найти ее координационного центра с помощью бизнес-карта. Отметить этот позицию на макетной плате. Теперь, выключите лазер полностью - это важно, так как бродячих или незатухающей лазерный свет может повредить самой ФЭУ. Позиция PMT так, что его активная область расположена как можно ближе к отмечены координатором насколько это возможно. Подключить ФЭУ сборки фокусирующей линзы использованием регулируемой трубы объектива, и тщательно обернуть темной лентой вокруг все открытые пути пучка следующие отверстие.
7. Включите лазер, но не забудьте сохранить свою власть крайне низким, что флуоресценция излучения едва заметны. Включите PMT, внимательно читаем свою напряжения на осциллографе как управляющее напряжение увеличивается. PMT генерирует сигнал через ряд этапов электронного умножения, если фототока слишком высока для уровня падающего света, труба может бытьнанесен непоправимый ущерб. ФЭУ с ограничением тока схемы, таким образом, настоятельно рекомендуется, особенно для пользователей, которые не работали с такими детекторами раньше.
   Увеличение ФЭУ напряжения до всплеска, как считывание и / или постоянного тока смещения можно увидеть на экране осциллографа, для большинства ФЭУ, этот сигнал будет отрицательным по отношению к земле. Убедитесь, что этот сигнал в самом деле возникает из-за флуоресценции, поворачивая лазер выключения наблюдать потерю сигнала.
8. Наконец, итеративно выровнять отверстия для максимального сигнала на экране осциллографа, сначала манипулирование фокусирующей линзы Z-позиции, а затем отрегулировать этапе уг перевода.
9. Видео-курс микроскопом аппаратных завершена! Теперь подключить зеркала, пользовательские щит управления, и компьютер, как схематически на рис 3. Как и выше, рекомендуется использовать системы визуализации сначала визуализировать известного размера стандартной, чтобы найти оптимальное разрешение микроскопа и рассчитать пикселей-Для разрешения постоянной для визуализации системы. Есть много стандартов размера, который может быть использован, например, белый визитные карточки с известным письмом размеров, флуоресценция или отражающих цели военно-воздушные силы, и флуоресцентные микросферы.

5. Подготовка системы для конфокальной сканирующей microendoscopy

В этой сборке мы используем когерентные волокна образ, который представляет собой пучок из многих тысяч волокна стержней; такой механизм позволяет изображение, которое будет передаваться через волокна и легко реконструированы и / или расширение на другом конце (рис. 4). Когерентный пучок волокна, используемого в строительстве этого эндоскоп полированного с обоих концов, что делает его так называемая "контактная режиме" microendoscope. В фокусе изображения будут делаться лишь формируется, когда microendoscope наконечник принес в тесном контакте с объектом. В этой псевдо-конфокальной договоренность, сканирование действия микроскопа фокусируется на одном лазерном еИбер ядро ​​за один раз, в то время как конфокальной отверстие гарантирует, что ни вне фокусировать свет от окружающих волокон пропускает к детектору. Для различных приложений визуализации, набор линз могут быть добавлены на дистальный конец, чтобы учесть обращенные вперед, междугородной флуоресценции. Microoptic линз, а также градиентом показателя преломления (GRIN) линзы могут быть легко адаптированы для такого использования, и могут быть прикреплены к дистального конца волокна с использованием оптического клея качества.

1. Для настройки изображения системы microendoscopy, тщательно удалить предметный столик и заменить его на этапе проведения волокна (рис. 5). Опустите один конец расслоения в слабый раствор красителя, так что флуоресценцию излучение генерируется равномерно через все волокна ядер. Включите систему сканирования и настроить волокна держатель принести другой конец расслоения (проксимального конца, или край, ближайший к микроскопу оптики) в фокусе. Во-первых, использовать перевод регулировки экрСРП по центру волокна в отсканированных области. Теперь посмотрите на изображение флуоресценции излучения проксимальных кончик волокна во время сканирования. При всей поверхности microendoscope находится в фокальной плоскости объектива, флуоресценция выбросов во всех волокна ядер будет максимально однородные. Используйте угол ручки регулировки для настройки волокна лицо, чтобы сделать все волокна ядер равномерно яркой. Во время этой перестройки, скорее всего он будет необходимо заново настроить перевод может заново центре волокна в отсканированных области. Перебор эти корректировки, пока весь кончик волокна правильно в фокусе.
2. Перед использованием microendoscope, осторожно очистите дистального конца использованием чистки линз бумаги слегка смоченной ВЭЖХ-класса метанола. Как и прежде, использовать известные стандартные размеры для измерения и расчета разрешающей способности системы визуализации microendoscope.

6. Представитель Результаты:

На рисунке 6 показан пример готового упрIGHT конфокальный сканирующий микроскоп настроен на microendoscopy. Лазерное излучение и пучки были разработаны в качестве руководства для глаз. Крепление волокна содержит изображение волокна в месте во время работы microendoscopy. Это волокно крепление может быть легко заменен ху или хуг перевод этапе для использования в качестве платформы вертикального микроскопа. ThorLabs части PT3 (XYZ перевод) или два сложенных PT1 этапов (XY перевод) хорошо работают для этого приложения, вместе с правой угловой скобки, такие как ThorLabs часть AP90.

Видео-курс framegrabber карта используется для создания изображения из входящего сигнала. На рисунке 7 показана представитель тестовое изображение принято в нижнем регистре "м" напечатаны на белой карты бизнеса с помощью видео-курс сканирующего микроскопа системы. Отбеленные белой бумаги содержит флуорофоры, возбужденных УФ и синего света, в результате чего светлом фоне за темными букву "м". Выбросов фильтр с центром в точке 515 нм была выбрана, чтобы собрать эту флуоресцентного свечения. Мinor искажения изображения можно наблюдать, особенно вблизи боковых краев кадра. Это искажение результатов синусоидальной шаблон сканирования 8kHz зеркало gavlo, и будут подробно обсуждены ниже.

Рисунок 1. Диаграмма демонстрирует принцип работы конфокальной микроскопии. Лучи, выходящие из объективной фокус передается обратно через систему и целенаправленной через конфокальной обскуры (красный). Лучи, происходящих либо выше (синий) или ниже (зеленый) цель фокус не возникают из объективной коллимированного, и поэтому не эффективно передается через конфокальной отверстие.

Рисунок 2. Схема всех легких путей через систему сканирования луча. Сканирования зеркала сидеть на самолетах с телецентрической станциистационарных, объективной плоскости диафрагмы обратно. Пары линзы между неподвижными плоскостями акт для передачи отсканированных лучей. Первые два реле линзы имеют равные фокусных расстояний, образуя телескоп 1:1. Вторая пара линз, известных как формально, объектив сканирования и трубка объектива, не должны быть равны в фокусного расстояния, и часто служат луч расширяется телескоп обеспечить объективный назад апертурой переполнен. Свет излучается из образца путешествует обратно через систему сканирования и проходит через дихроичных зеркал. Короткий фокус объектива фокусируется излучение света через конфокальной отверстие, которое затем коллимируется объективом. Окончательный линза фокусирует конфокальной фильтрацией выбросов на ФЭУ. Нажмите здесь, чтобы посмотреть полноразмерные версии этого образа.

Рисунок 3. () Обзор диаграмме сканирования электроники установки. Общая ссылка микроскопа сигнала и развертки является "синхронизация" TTL выход быстрой оси резонансной зеркало galvo, который генерирует TTL импульса на конце каждой строки проверки (т. е. при galvo завершила проверку цикла). Это обеспечивает H-синхронизации сигнал framegrabber карты. Выход синхронизации galvo является также связано с V-Sync плата управления, которая постепенно увеличивает его выходное напряжение в ответ на каждый H-синхроимпульса для генерации сигнала пилообразной, что диски оси медленное сканирование. Как только все линии были отсканированы, V-Sync плата сбрасывает пилообразного сигнала и генерирует импульс TTL, которая служит V-сигнала синхронизации framegrabber в. Окончательный ввод в framegrabber карта аналогового сигнала с ФЭУ (Заметим, что многие ФЭУ вызывают отрицательные выходного напряжения, будьте уверены, чтобы создать свой контург выбрать вашего оборудования соответственно). Видео-курс изображения генерируются и отображаются в программном обеспечении framegrabber Matrox. (Б) Пример схемы управления. В этом проекте, напряжение каждой H-Sync импульс ", добавил" / интегрированы в ОУ интегратора для создания рампы пилообразного сигнала; импульсы одновременно учитываются на стадии счетчик TTL. Когда нужное количество линий была достигнута (то есть, когда в результате проверки растр полный), счетчик генерирует активный низкий "осуществляют" импульс, который приводит в действие триггера Шмитта для генерации импульса сброса для интегратора. Это сбрасывает оба счетчика и интегратора ОУ, подготавливая цепь для следующего цикла. Соответствующий выбор компонентов делает эту схему широко применимы к различным растровых размеров. Это только одна реализация, многочисленные другие реализации возможны и могут быть предпочтительными при определенных обстоятельствах. Кроме того, эта схема предназначена для использования с картой Matrox framegrabberс, что обнаружить и исправить изображения фаза автоматически. Если схема будет использоваться с другими framegrabbers, фаза коррекции схемы или программного обеспечения, которые могут потребоваться. Нажмите здесь, чтобы посмотреть полноразмерные версии этого образа.

Рисунок 4. Передача изображения через когерентного пучка волокон. В этой схеме, линзы по обе стороны от расслоения в месте, чтобы масштаб и изображение проецируется на входной расслоения, а также расширить изображение на выход волокна расслоения.

Рисунок 5. Пример расслоения установлена ​​в 5-осевой монтирования. Малых 1 "диаметр алюминиевого блока было скучно, так что пучок изображение волокно может быть вставлено. Волокна epoxied внутри алюминиевого блока на ботч верхней и нижней части блока для устойчивости.

Рисунок 6. Изображение завершена микроскопии системы с microendoscope прилагается. Чтобы лучше представить себе легкий путь, путь возбуждения пучок изображены синим цветом, в то время пути пучка излучения после дихроичных зеркал рисуется как красная линия.

Рисунок 7. Пример изображение, формируемое видео-курс конфокальной микроскопии системы сканирования. Темно строчная буква «м» появляется на ярком фоне флуоресценции белых визитных карточек.

Этот видео-курс изображения система использует резонансный гальванометрические операционной зеркала около 8 кГц. Резонансные зеркала может быть довольно громким, когда запущен на полную мощность, и их высокая шаг может быть надоедливым или даже опасно при достаточном времени экспозиции. Хотя это и не показано здесь, рекомендуется, чтобы оградить резонансных гальванометрические зеркало внутри прозрачный корпус, чтобы значительно уменьшить объем системы и / или носить соответствующую защитную одежду слушания, например, затычки для ушей.

Резонансное сканирование гальванометрические зеркало в синусоидальный узор. Тем не менее, framegrabber карт читать в сигнал предполагая вполне линейных скорость развертки и в горизонтальном и вертикальном направлениях. С синусоидальной развертки замедляется по краям сканирования, артефакты сжатия изображения можно наблюдать вдоль быстрой (по горизонтали) изображение оси. Один из путей минимизации этой проблемы является специально диск резонансных зеркало galvo сканирования диапазона значительно больше, чемРеле диаметра объектива. При этом только близка к линейной центральной размах синусоидальной шаблон сканирования будет проходить образца, сводя к минимуму искажения изображения. Другой подход заключается в пост-обработки изображений собраны линеаризовать быстрой оси. Это может быть достигнуто путем изображения известных флуоресцентных шаблону (например, сетка) и используя известные размеры шаблон для создания обработки скрипта, который unwarps собраны изображения.

Данная система сканирования была разработана с целью в естественных изображений, что часто требует вертикально ориентированных видео-курс микроскопом. Для сотовых экспериментов с изображениями, инвертированные микроскопы более обычно используется. Дизайн, представленные здесь могут быть легко изменены, чтобы построить такую ​​инвертированного микроскопа, все что требуется, это вращение окончательного 2 "диаметром зеркала. Вместо того, ориентируя зеркало направить сканирующий луч вниз, зеркало может направить луч вверх. Размещение объективат на таком же расстоянии от зеркала, а также предметный столик позволит изображений в перевернутом геометрии. Если изображение системы строится исключительно для microendoscopic изображений, нет никаких причин, чтобы "раз" микроскоп вертикальное вообще. Вместо этого, вся система сканирования может быть построен на одной горизонтальной макет с объективом ориентированных параллельно оптической таблице.

Обратите внимание, что микроскоп в этой сборке использует фиксированную конфигурацию отверстия, в то время это обеспечивает наибольшую построить простота и легкость выравнивания, пользователей, желающих более универсальной системы может рассмотреть вопрос о включении переменной обскуры, как можно найти в большинстве коммерческих конфокальной микроскопии. Позволяя пользователю регулировать размер отверстия для компенсации образцов различной интенсивности излучения, что позволяет пользователю лучше оптимизировать компромисс между силой сигнала и разрешение для данного образца.

Чголоса изображения волокна, отобранных для микроскопа имеет важное значение. Мы рекомендуем использовать Sumitomo когерентные волокна изображения из-за их близкие расстояния сердцевины волокна и низкой относительной флуоресценции. Изображение волокна производства Fujikura было обнаружено большое количество аутофлюоресценция ^10, который может сокрушить слабую флуоресценцию сигналы от образца и ограничить предельную чувствительность microendoscope. Sumitomo производства волокон, таких как 8-30N, используемые в этой конкретной установки, имеют значительно более низкие уровни аутофлюоресценция, чем их эквиваленты Fujikura. Хотя ед расслоениях можно считать привлекательным для microendoscopy, их дизайн обычно места отдельных ядер волокна слишком далеко друг от друга, а это означает, что слой ядер редко объектов образца, в результате чего из значимых регионах, представляющих потенциальный интерес.

Наконец, следует отметить, что в то время как микроскоп описанных здесь, будет полезна в самых разных, в пробирке и в естественных применДополнения и может быть создан на долю стоимость полнофункционального коммерческая система, она не имеет таких функций, как проходящем свете обнаружения, окуляр для просмотра, или луча для не-конфокальной широкопольных epifluorescence. Хотя вполне возможно построить систему с этими функциями с нуля, читатели желающих такой системе вы можете изменить существующие коммерческие системы для удовлетворения своих потребностей, а не инициировать совершенно новый построить.

Производство этого видео-это видео было организовано Thorlabs, Inc

Авторы хотели бы поблагодарить ThorLabs за поддержку этого проекта. AJN хотела бы отметить поддержку NSF стипендий.

Данная работа частично финансируется Национальным институтом здоровья посредством новой программы Новатор премии NIH директора, грант № 1 DP2 OD007096-01. Информация о новой программе Новатор премии находится на http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/ . Авторы хотели бы поблагодарить Том Хейс за использование Гарвардского Электроника лаборатории.