Высокая пропускная способность дрожжей плазмиды экрана Сверхэкспрессия

Здесь мы опишем плазмиды экране гиперэкспрессия в Saccharomyces CEREVISIAE, С помощью выстроились плазмиды библиотеки и высокой пропускной способности дрожжей преобразования протоколов с жидкого робота обработки.

Почкующихся дрожжей, Saccharomyces CEREVISIAE, представляет собой мощную систему модель для определения фундаментальных механизмов многих важных клеточных процессов, в том числе имеет непосредственное отношение к болезни человека. Из-за короткого времени генерации и хорошо изученных геномов, основным преимуществом экспериментальной модели системы дрожжей способность выполнять генетических экранов, чтобы идентифицировать гены и пути, которые участвуют в данном процессе. За последние тридцать лет такие генетические экраны были использованы для выяснения клеточного цикла, секреторный путь, и многие другие высоко консервативные аспекты эукариотической клеточной биологии ^1-5. В последние несколько лет, несколько библиотек genomewide штаммов дрожжей и плазмиды были получены ^6-10. Эти коллекции позволяют сейчас для систематического допроса функции гена использованием усиления и потерей функции подходы ^11-16. Здесь мы предлагаем подробный протокол для использования высокопроизводительного протокола трансформация дрожжи с жидкого робота выполнять обработку плазмиды экране гиперэкспрессия, используя выстроил библиотеку в 5500 плазмиды дрожжей. Мы используем эти экраны для выявления генетических модификаторов токсичность, связанная с накоплением агрегации подверженных человека нейродегенеративные заболевания белки. Методы, представленные здесь, могут быть легко приспособлены к изучению других клеточных фенотипов интерес.

1. Подготовка к преобразованию дрожжей

Этот протокол разработан в течение десяти 96-луночных планшетах, но можно масштабировать вверх или вниз соответственно. Мы обнаружили, что этот протокол не работает уже более двадцати 96-луночных за раунд трансформации. Вся процедура преобразования (с шагом I.3) займет примерно восемь часов.

1. Алиготе 5-10 мкл плазмидной ДНК (100 нг / мкл) из дрожжей библиотеки FLEXGene ORF в каждую лунку с круглым дном 96-луночный планшет с биоробот RapidPlate жидкости обработчик. Место обнаружили 96-луночных планшетах в чистом столе вытяжной шкаф ночь для просушки. Мы нашли подобные эффективность преобразования с ЕКС и плазмиды 2μ дрожжей.
2. Привить 200 мл дрожжевой пептон декстрозы (YPD) СМИ (10 г / л дрожжевого экстракта, 20 г / л пептона, 20 г / л глюкозы) с запросом напряжение в 500 мл колбу Эрленмейера, сбитый с толку. Выдержите в течение ночи при 30 ° C при встряхивании (200 оборотов в минуту). Если потребуется, селективные среды также могут быть использованы для этих заквасок.
3. На следующее утро, развести запрос штамма к OD ₆₀₀ = 0,1 в 2 л YPD. Встряхните в течение 4-6 часов при температуре 30 ° C (200 оборотов в минуту), пока культура достигает OD ₆₀₀ = 0,8-1,0. Для оптимального роста, вырастают две 1L культур в отдельном 2,8 л тупик колб. Если потребуется, селективные среды также может быть использован вместо YPD.

2. Дрожжи преобразования

1. Урожай клетки центрифугированием. Заполните четыре одноразовых 225mL конических пробирок с культурой дрожжей и спина при 3000 оборотов в минуту (~ 1800 мкг) в течение 5 минут в настольной центрифуге (Eppendorf 5810R). Слейте надосадочную и повторять, пока все клетки собирают.
2. Вымойте клеток в 200 мл дистиллированной из автоклавного H ₂ O. Ресуспендируют осадок клеток путем встряхивания или вортексе. Комбинат ячеек в одном 225mL коническую трубку. Спиновые на 3000rpm в течение 5 минут. Удалить супернатант.
3. Подготовка 0.1MLiOAc/1XTE раствора (0,1 М LiOAc, 10 мМ Tris, 1 мМ ЭДТА, рН 8 в автоклаве дистиллированной воды). Вымойте клеток в 100 мл 0.1MLiOAc/1XTE. Спиновые на 3000rpm в течение 5 минут. Удалить супернатант.
4. Ресуспендируют осадок клеток в 70 мл 0,1 М LiOAc/1xTE. Встряхните и / или вихревые для обеспечения гранулы полностью ресуспендировали.
5. Инкубируйте при встряхивании при температуре 30 ° С в течение 30 минут (200 мин).
6. Добавить β-меркаптоэтанол до 0,1 М. Инкубируйте при встряхивании при температуре 30 ° С в течение 30 минут (200 мин). Примечание: Этот шаг может быть опущена при использовании штаммов дрожжей, которые чувствительны к β-меркаптоэтанола. Мы обнаружили, что этот шаг не является необходимым для успешной трансформации, однако это улучшение эффективности трансформации.
7. Кипятить 2 мл ультразвуком ДНК спермы лосося (10mg/mL) в течение 15 минут, а затем охладите на льду.
8. Добавить 2 мл вареной ДНК спермы лосося в ячейку смесь. Внимание: может образоваться осадок при добавлении ДНК спермы лосося в клетку смесью. Использование pipetman и 200 мкл наконечник, тщательно удалить осадок, что формы, поскольку это может мешать течению пипетки.
9. Алиготе 50 мкл клеточной смеси в каждую лунку 96-луночного планшета использованием Rapidplate биоробот (можно также использовать многоканальную пипетку). Не смешивайте.
10. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут без встряхивания.
11. Подготовка 200 мл 40% PEG-3350/10% DMSO/0.1M LiOAc (160mL 50% ПЭГ-3350, 20 мл ДМСО, 20 мл 1М LiOAc). Подготовка решения непосредственно перед употреблением.
12. Добавить 125μL ПЭГ / LiOAc / ДМСО раствора в каждую лунку. Смешайте по аспирационных и дозирования суспензии клеток в восемь раз с RapidPlate.
13. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут без встряхивания.
14. Тепловой удар клетки на 42 ° С в течение 15 минут в сухой инкубатор. Не ставьте пластин. Примечание: Мы обнаружили, что этот шаг теплового шока не является необходимым для успешного преобразования. Для некоторых штаммов дрожжей (например, температуры чувствительных мутантов), теплового шока является вредной для здоровья. Ранее мы уже сократили время теплового шока до одной минуты и были в состоянии успешно трансформировать штамм дрожжей укрывательство ypt1 чувствительны к перепадам температур мутации с помощью этого протокола.
15. Спиновые пластин при 2500rpm (около 1100 мкг) в течение 5 минут, используя центрифугу адаптеры для размещения 96-луночных планшетах. Удалить PEG решение путем обращения пластин за отходами ведро. Пятно перевернутую пластину на бумажное полотенце, чтобы удалить остатки жидкости (клетки останутся на дне скважины).
16. Промойте клетки путем добавления 200 мкл минимальных средствах массовой информации (например, SD /-УПА) в каждую лунку с RapidPlate.
17. Спиновые пластин на 2500rpm в течение 5 минут и удалить супернатант обращения за ведро отходов и промокательной на бумажных полотенцах.
18. Добавить 200 мкл минимальных средствах массовой информации (например, SD /-УПА) в каждую лунку с RapidPlate.
19. Инкубировать при 30 ° С в течение 2 дней без встряхивания. Через 2 дня, небольшими колониями клеток должны начать форму внизу каждой успешно преобразовали хорошо.

3. Зрительные анализа

1. Внесите 200 мкл раффиноза основан минимальные средства массовой информации (например, SRaf /-Ура) в каждую лункуновые плоским дном 96-луночный планшет.
2. Смешайте каждую лунку трансформации пластины аспирационных и дозирования суспензии клеток в восемь раз с Rapidplate.
3. Привить SRaf пластин с 5 мкл клеточной смеси от трансформации пластины.
4. Инкубировать при температуре 30 ° С в течение одного дня. Малый колонии должны присутствовать на дне каждой лунки после одного дня.
5. Пятно колонии на SD /-Ура и SGal / Ура-плит в капюшон. Стерилизовать 96-болт репликатор (Frogger) на пылающий. Смешайте колонии с Frogger до кровянистые выделения на селективной пластинами СМИ. После кровянистые выделения, позволяют пластин сушить в капот на 5-10 минут.
6. Инкубировать при температуре 30 ° С в течение 2-3 дней.

Фотография пластины с цифровой камеры, и визуально сравнить рост колоний на SGal /-Ура пластин найти колонии, в которых запрос токсичности штамма усиливается (медленный рост / менее плотные колонии) или подавлены (быстрый рост / более плотные колонии).

4. Представитель результаты:

Рисунок 1. Дрожжевой плазмиды экране гиперэкспрессия определить супрессоров и усилители TDP-43 токсичности. TDP-43 является человеческий белок, который был замешан в патогенезе бокового амиотрофического склероза (болезнь Лу Герига). Цитоплазматическая агрегатов TDP-43 накапливаются в головном и спинном нейронов шнур пациентов с БАС ^17. Выражая TDP-43 в клетках дрожжей приводит к агрегации и цитотоксичность ^18. Мы использовали эту модель системы для определения механизмов TDP-43 токсичности ^19,20. Показаны примеры repesentative плит из наших дрожжей TDP-43 токсичность модификатор экране. Эти плиты дисплей колонии с интегрированным галактоза-индуцируемых TDP-43, а также плазмиды трансформированных плазмидами из выражения библиотеки FLEXGene ORF. Пластину слева содержит глюкозу, которая подавляет экспрессию TDP-43 или FLEXGene плазмид. Пластину справа содержит галактозу, который индуцирует экспрессию TDP-43 и ORF, в плазмиды FLEXGene. Зеленая стрелка указывает колония трансформированных плазмидой, который подавляет токсичность TDP-43. Красная стрелка указывает колония трансформированных плазмидой, что усиливает токсичность TDP-43.

Здесь мы приводим протокол для выполнения высокой пропускной способности плазмиды экране гиперэкспрессия в дрожжах. Такой подход позволяет оперативно и объективную скрининг на генетические модификаторы многих различных клеточных фенотипов. Используя этот подход, исследователь может экрана значительную часть генома дрожжей в течение нескольких недель. Это объективный подход позволяет также для идентификации модификаторы, которые, возможно, не были предсказаны на основе предыдущих результатов. Мы использовали этот подход к выявлению модификаторов токсичность, связанная с агрегацией белков человека нейродегенеративных заболеваний ^19,21-23. Однако из-за адаптации этого протокола для изучения других клеточных процессов, этот протокол будет полезной для исследователей, решение широкого круга важных биологических вопросов. Например, мы также нашли эту скрининга подход полезен для идентификации генов и путей, участвующих в адаптации к экологическим стресс, в том числе тяжелые металлы и окислительного стресса. Здесь мы сосредоточили свое внимание на одной плазмиды библиотеки, библиотеки дрожжей FLEXGene ^9. Однако Есть несколько других дрожжей плазмиды библиотек, доступных, которые также могут быть использованы для этих экранов ^6,8.

Эта работа была поддержана грантом Packard Центр ALS исследований в Университете Джона Хопкинса (ADG), Нью-премии Новатор NIH директора 1DP2OD004417-01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), Рита Аллен Фонд ученый Award. ADG является выпускником школы Пью в медико-биологических наук, при поддержке Благотворительные фонды Пью.