Эпидемиологического надзора за птичьим гриппом с FTA карты: Полевые методы, биобезопасности и транспорта Вопросы Решенные

Метод сохранения, выявления и последовательность РНК из вирусов птичьего гриппа была подтверждена и расширенного использования природных образцах помета от птиц. Эта техника устраняет необходимость поддержания прохладно цепи и обработки инфекционных вирусов и может применяться в 96-и высокую пропускную способность установки.

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans¹. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral subtypes². Human pandemics of flu originally stem from AIVs³. Many fatal human cases during the H5N1 outbreaks in recent years were reported. Lately, a new AIV related strain swept through the human population, causing the 'swine flu epidemic'⁴. Although human trading and transportation activity seems to be responsible for the spread of highly pathogenic strains⁵, dispersal can also partly be attributed to wild birds^{6, 7}. However, the actual reservoir of all AIV strains is wild birds.

In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains^8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised^{13, 14} and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)^15-17. Recently, Kraus et al.¹⁸ introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards¹⁹ preserve RNA on a dry storage basis²⁰ and render pathogens inactive upon contact²¹. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.

In the study of Kraus et al.¹⁸ a laboratory isolate of AIV was used, and samples were handled individually. In the extension presented here, faecal samples from wild birds from the duck trap at the Ottenby Bird Observatory (SE Sweden) were tested directly to illustrate the usefulness of the methods under field conditions. Catching of ducks and sample collection by cloacal swabs is demonstrated. The current protocol includes up-scaling of the work flow from single tube handling to a 96-well design. Although less sensitive than the traditional methods, the method of FTA cards provides an excellent supplement to large surveillance schemes. It allows collection and analysis of samples from anywhere in the world, without the need to maintaining a cool chain or safety regulations with respect to shipping of hazardous reagents, such as alcohol or guanidine.

1. Перехват Дак и клоаки Свабирование

1. Ловушка речные утки рода Anas (или другой птицы) в клетке за счет привлечения их заманить уток или продуктов питания, и поместить их в отдельные коробки плате карты. Транспорт раз в соответствующем окне должно быть сведено к минимуму, например, путем установки полевая станция находится на небольшом расстоянии к ловушке. Логистическая обстоятельства могут меняться в каждом исследовании. Советы и утверждения соответствующих животных комитета по этике должна быть искали для каждой новой установки. Кроме того, также охотник выстрелил птицы могут быть отобраны.
2. Возьмите утку из коробки, удерживая ее крылья плотно прилегает к его телу. Пример свежий снижается, которая будет присутствовать в большинстве случаев, непосредственно из нижней части окна. Забрать их стерильным тампоном и нанесите жидкость для карт ватмана ССТ. Если нет, выполните клоаки моечные.
3. Включите утку на спину. Это дает возможность доступа к клоаке и облегчает отбор проб. Клоаки выступающие структура расположена ниже живота, ближе к основанию хвоста. Опытный человек мог держать и образцы птицы в то же время, или же второй человек может помочь.
4. Осторожно вставьте стерильные пластиковые района тампоном (Копан, Италия) около 1 см и сделать нежным вихрем клоаку. Ролл тампон жидкостей из клоаки по поверхности карты ватмана ССТ. После отбора проб был выполнен немедленно освободить животное является желательным.
5. Сухой FTA карт при комнатной температуре не менее 1 часа, затем сохранить каждый образец индивидуально в бумажных пакетах (например, конверты). Хранение можно при комнатной температуре, возможно, с бисером кремнезема во влажном климате. Отправка и получение биобезопасности учреждений офицеры могут позволить отправить FTA карты по почте, так как возбудители становятся неактивными при контакте с поверхностью карты ЗСТ.

2. Вирусный изоляции РНК

1. Извлечение материала FTA карты, включая фекалии / клоаки жидкость. Удар три диска с Харрисом 2 мм перфоратор и место всех тех, в скважины пластины РНКазы свободной 96well. Между каждым нового образца, чистый панчер осторожно с алкоголем и точность Ким протрите (KIMTECH). Всегда используйте положительные и отрицательные контроли. Положительного контроля может состоять из лабораторного штамма свеженанесенный на карту зоны свободной торговли, или природном образце которого знаете, получая положительный результат. Как отрицательный контроль, выбивать диски из пустой картой ЗСТ. Кроме того, оставьте другой хорошо бесплатным для контроля ПЦР позже в эксперименте (с водой как шаблон).
2. Добавить 70μl РНК быстрой экстракции раствором (Амбион) и рулонн пластины (AbGene Термо-Sealer). Выдержите 5 минут на планшетном шейкере при комнатной температуре определяется скоростью, которая не вызывает перелив (это зависит от используемой модели пластины шейкер; тест заранее).
3. Проведение вирусных РНК изоляции в соответствии с протоколами производителя с MagMAX-96 вирусных РНК изоляции комплект (Амбион). Вкратце: Добавить 130μl подготовлены лизиса / обязательные решения (из комплекта) в каждую лунку. Передача 50 мкл извлеченные FTA карты материала в каждую лунку. Встряхните пластины на 1 минуту.
4. Добавить 20 мкл подготовленных шарик смеси (из комплекта) для каждого образца и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Встряска на определенные скорости в течение 5 минут. Молекулы РНК связываются с магнитными бусами.
5. Перемещение пластины для магнитного 96-луночного стоять, чтобы захватить бисером. В зависимости от модели магнитной стенд используется, это может занять более 5 минут. Когда раствор получился совершенно ясно, удалить и уничтожить супернатант. Затем удалить пластину из магнитного стенда.
6. Вымойте бисером дважды промывочного раствора 1 и дважды промывочного раствора 2 (из комплекта). Для каждого из 4 шагов мыть добавить 150 мкл приготовленного раствора мыть к каждой пробе, встряхивать в течение 1 минуты определяются скорость, перемещение пластины магнитного стенд, захват бисером в течение приблизительно 5 минут (или пока раствор не вполне ясно), удалять и отбросить супернатант. Затем удалить пластину из магнитного стенд, добавить следующее решение мыть, и проводить промывки, как раньше. После последней промывки, удалить как можно больше моющего раствора, как это возможно и сухой воздух бисером при комнатной температуре в планшетном шейкере в течение 2 минут.
7. Добавить 50 мкл буфера элюирования (из комплекта), чтобы освободить РНК из бисера и встряхивают в течение 4 минут на пластину шейкер. Захват бисером, как описано выше. Супернатант теперь содержит изолированных РНК, которая готова для последующих применений.

3. RT-PCR из ВГП Матрица Гена

Провести обратной транскрипции ПЦР (RT-PCR) с One-Step доступа RT-PCR системы (Promega) в 25 мкл реакции (в диапазоне от Краус и др. ¹⁸ и Fouchier и др. ^22..):

Условия ПЦР в Biometra T1 амплификаторе являются: начальный обратной транскрипции 45 минут при 45 ° C, затем 2 минуты начальная денатурация при 94 ° С и 40 циклов: 94 ° С в течение 1 минуты, 56 ° С в течение 1 минуты, а 68 ° С в течение 2 минут. Дополнительное удлинение 7 минут при 68 ° C заключает усиления.

4. Скрининг на АИ-положительные образцы и очистки целевых фрагментов из геля

1. Нагрузка 2μl продукта ПЦР смешанного с 5x 2μl красителя нагрузки (BioRad) и 6μl воды на 1% агарозном геле (Roche) окрашивали 1% этидия бромид (2.5μl на 100 гель мл) для предварительного отбора.
2. Выполнить гель течение 1 часа при 120 В, наряду со стандартным размером ДНК (BioRad EZ нагрузка 100 б.п. лестнице), визуализировать с документацией по системе гель. Смотрите пример на рисунке 1.
3. Выберите образцы с амплифицированных фрагментов в ожидаемый диапазон размеров (от 200 б.п. и 300 б.п. (целевой фрагмент 244 пар оснований). Нагрузки всей реакции ПЦР объем (из которых ~ 23μl осталось) из этих кандидатов с 5-кратным 6μl красителя нагрузки на 2 бромид этидия% агарозном геле, окрашивали и запустить в течение 2 часов.
4. Место гель на УФ-transilluminator (Bioblock Scientific) и осматривается. Смотрите пример на рисунке 2. Акцизный полосы нужного размера из геля с помощью скальпеля и помещены в отдельные пробирки на 1,5 мл реакции. Purify фрагментов из геля, например, с Zymoclean ДНК гель Восстановление Kit (Zymo исследований).

5. Секвенирование и идентификации продуктов ПЦР

1. Провести Сэнгер секвенирования целевой фрагменты, например, на ABI 3730 капиллярной секвенсор с ABI Большой Dye 3,1 химия (Applied Biosystems). Подготовка последовательность реакций в 10 мкл томов, содержащих 10-20 нг гель-очищенной шаблон кДНК, 1.75μl 5x буфера разбавления, 0.5μl Большой Dye V3.1 премикс, 1 мкл прямого праймера (M52C ^20, 10 мм), а ddH2O. Велоспорт условиями являются: 1 мин начальной денатурации, после 25 циклов: 10 секунд при 96 ° С, 5 с при 45 ° С и 4 мин при 60 ° C. Purify и подготовить последовательность реакций в соответствии с вашими внутренними протоколами.
2. Определить результате кДНК против нуклеотидных баз данных, таких как GenBank23, например, веб-инструменты, такие как взрыв на Национальный центр биотехнологической информации (NCBI, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).

6. Представитель Результаты:

Кряквы (Anas platyrhynchos) были отобраны на Ottenby Птица обсерватории в декабре 2007 года. От каждого кряква образца на FTA карта была взята, как описано в данном протоколе. После доставки, FTA карты хранились в морозильнике при температуре -20 ° С в течение двух лет. Же карта FTA образец лаборатории изолировать испытания в Краус и соавт. ¹⁸ был включен в качестве положительного контроля, а также девять десятикратно серийные разведения его. Два отрицательных контролей были я) извлечение из пустых карт FTA, чтобы проверить, есть ли перенос средств с нокаутером, и б) RT-PCR реакции, в которой нуклеазы свободной воды был использован в качестве шаблона, чтобы проверить, если заражение произошло во время или в подготовке реакции ПЦР.

84 образцов были проанализированы. Гель картину продуктов ПЦР из этих 84 образцов можно найти на рисунке 1. Из натуральных образцов множества неспецифических полосы можно наблюдать из-за наличия различных примесей микроорганизмов в фекалиях. Тем не менее, целевой фрагмент пары праймеров составляет 244 б.п. долго. Весь ПЦР-реакции объема подмножество образцы, которые производятся фрагменты примерно правильный диапазон размеров (от 200 б.п. и 300 б.п.) был загружен на гель (рис. 1). Иллюстрация того, какие из полос, вырезанных из геля можно найти в дополнительном рисунке 1. В дополнение к положительным контролем, два из этих образцов (69899 и 69912) были положительны на новый протокол. BLAST поиска по базе данных NCBI нуклеотидных установлена ​​личность, как А. И. матрицу гена (рис. 3), тогда как все другие группы напоминали бактериальных последовательностей, наиболее тесно, или не дали последовательность читается на всех.

Рисунок 1. Гель картину предварительный отбор продуктов ПЦР. 2 мкл продукта ПЦР положительный контроль, зПерс разведений положительного контроля, два отрицательных контролей и 84 клоаки образцы были загружены. 48 образцов представлены в верхней панели гель, и 48 образцов в нижней панели. Красные стрелки указывают геля полосы для 100 б.п. стандартного размера ДНК. Для иллюстрации, красные кружки полосы ожидаемого размера диапазона. Синие кружки неспецифической ампликона (вверху слева) или артефакт грунтовки димера ниже 100 б.п. по размеру (внизу справа).

Рисунок 2. Отбор образцов с фрагментами в правильном диапазоне размеров. Образцы с полос частот между 200 б.п. и 300 б.п. (целевой фрагмент 244 пар оснований) были выбраны. Зеленая стрелка указывает на положительный контроль, две красные стрелки указывают образцов, которые были подтверждены быть AIV положительные путем сравнения их кДНК последовательностей нуклеотидных NCBI базе данных.

Рисунок 3. Экран захвата представитель поиска BLAST в NCBI. Одной из кДНК последовательностей, полученных от вырезали фрагменты Был задан вопрос в отношении нуклеотидных баз данных на веб-сайте NCBI. Образец правильно определил, как А. И. фрагмента гена Matrix. Для просмотра полную версию этого изображения, нажмите здесь.

S1 Дополнительный рис. Полосы отобранных образцов вырезали из геля. Эта фотография была сделана из геля, изображенный на рис 1 после кандидатом полос частот между 200 б.п. и 300 б.п. были вырезаны.

Протокол, описанный здесь, обеспечивает дополнительный метод для выявления фекального или аналогичных образцов на наличие ВГП. Он был специально разработан, чтобы сделать пробы быстро и легко. Это дает возможность для менее образованных лиц, например, охотники или диких животных, менеджеров, внести свой вклад в наблюдение AI. Нет прохладный цепи должны применяться, хотя и замораживания образцов рекомендуется там, где это возможно. Несколько дней комнатной температуре, например, во время транспортировки в лабораторию, не были проблемой для молекул РНК на картах FTA тех пор, пока карты остались сухими. Прочие охлаждение систем хранения данных, которые в настоящее время оцениваются научным сообществом, таких как алкоголь ¹⁵ или гуанидина ^16, требуют специальных механизмов доставки из-за их опасный характер. В отличие от метода FTA карта не требует перевозки опасных материалов. Тем не менее, еще один интересный носитель в этом отношении является RNAlater ™, которые не являются опасными, либо ^17. Анализ проб может быть осуществлена ​​в любой стандартной молекулярной лаборатории. Никакого специального оборудования, кроме обычного для реакции ПЦР и секвенирования капиллярной было необходимо. Все шаги могут быть осуществлены без уровень биобезопасности, потому что уже на пробы потенциальных патогенных агентов были инактивируется антибактериальной и противовирусной активности карта FTA.

Перекрестного загрязнения и последующего ложных положительных образцов не наблюдалось в наших исследованиях с дикими образцы птицы. Однако при работе с РНК и ПЦР всегда целесообразно обратить особое внимание на чистые рабочие места и отдельные комнаты для пред-и пост-ПЦР шагов. Работа в вытяжной шкаф снижает риск аэрозольного загрязнения в лаборатории. Пипетирование должна осуществляться с фильтром советы.

Из предыдущих исследований на образцах, взятых одновременно из одной утки мы знаем, что шесть из 84 образцов были положительными по традиционной RealTime RT-PCR метод ²⁴ и Ct значения от RealTime RT-PCR известны. Два положительных образцах обнаружены нашего метода вытекают из утки которая Ct значения <30 (что указывает на высокую концентрацию вирусной РНК). Других четырех образцов, которые были положительны с традиционным протоколом, Ct значения> 30 (менее концентрированный) и не могли быть обнаружены с помощью нашего протокола.

Только образцы с относительно высоким титром вируса были положительными в нашем анализе, и вполне вероятно, что чувствительность метода была источником неспособность обнаружить все положительные пробы. Кроме того, размер выборки в данном исследовании была очень низкой, и метод может быть полностью разработаны и оценены, если более контролируемой и строгие эксперименты проводятся. Однако, если эти образцы были бы собраны из отдаленной местности, традиционного анализа не было бы вообще возможно. Кроме того, эти первые результаты обусловлены пилот эксперименты, которые нуждаются в дальнейшей оптимизации. Течение двух лет хранения в обычном -20 ° C морозильник после пробы, вероятно, также повлияло на качество вирусной РНК. Это возможно снижение РНК является важной проблемой при работе с комнатной температуре хранения инактивированных вирусов. Образцы хранятся в альтернативных жидкостей, как упоминалось выше страдают от значительного снижения, который влияет анализ больше участков вирусного генома ^16. Хотя это и не проверены в нашем исследовании, открыто карты оказались хорошо подходит для сохранения интактных молекул РНК в других системах РНК, которые очень похожи на вирусы птичьего гриппа ^{25, 26.}

Захват, обработка и отбор проб птиц были сделаны следующие национальные законодательства и были одобрены Шведский совет по вопросам сельского хозяйства и исследований животного комитета по этике.

We thank Bert Dibbits for technical assistance. The Animal Breeding and Genomics Group, Wageningen University, The Netherlands, generously hosted us in their laboratory. The personnel of the Ottenby Bird Observatory, Sweden, is thanked for trapping and sampling the mallards, in particular Magnus Hellström, Marcus Danielsson, Christopher Magnusson and Stina Andersson. We thank Sanne Svensson, Jonatan Qvist and Per-Axel Gjöres for filming at Ottenby, and Mano Camon for filming in the lab. Daniel Bengtson provided beautiful duck photographs for the video portion of this publication. Further free material from the CDC Public Health Image Library (PHIL; http://phil.cdc.gov/phil/) was used: The electron micrograph (no. 280; by Dr. Erskine Palmer) and illustration (no. 11823; by Douglas Jordan) of the influenza virus. Financial support was given by the KNJV (Royal Netherlands Hunters Association), the Dutch Ministry of Agriculture, the Faunafonds and the Stichting de Eik Trusts (both in The Netherlands), the Swedish Research Council (grant no. 2007-20774) and the EC-founded Newflubird project. RNA isolation chemicals were a generous gift of Ambion, Inc, the RNA company. This is contribution No. 245 from the Ottenby Bird Observatory.