Аденовирус-опосредованной Генетические Удаление сигнальных молекул в культуре первичных мышиных эмбриональных фибробластов

В этом видео мы используем аденовирус-носителей гена Cre рекомбиназы заразить первичных мышиных эмбриональных фибробластов проведения floxed Rac1 аллеля.

Способность к генетически удалить определенные компоненты различных каскадов сигнализации клетка была неотъемлемым инструментом в современном анализе передачи сигнала. Один конкретный метод для достижения этой условной удаление через использование Cre-loxP системы. Этот метод предполагает фланговые гена с сайтами loxP, которые являются специфическими последовательностями признания белка рекомбиназы Cre. Воздействие на так называемые floxed (окружении сайт loxP) ДНК, чтобы этого фермента приводит к Cre-опосредованной рекомбинации мероприятие в loxP сайтов и последующего вырезания промежуточных ген ^3. Несколько различных методов существуют, чтобы управлять Cre рекомбиназы к месту интерес. В этом видео мы продемонстрируем использование аденовируса, содержащего ген Cre рекомбиназы заразить первичных мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs), полученных из эмбрионов, содержащих floxed Rac1 аллель ^1. Наши обоснование выбора Rac1 MEFs для наших экспериментов является то, что ясно морфологические изменения можно увидеть на удаление Rac1, в связи с изменениями в актина цитоскелета ^2,5. 72 часов после вирусной трансдукции и Cre выражения, клетки окрашивали красителем фаллоидином актина и отображение с помощью конфокальной микроскопии лазерного сканирования. Было отмечено, что MEFs, которые были подвержены адено-вирус появилась Cre контракту и вытянутые в морфологии по сравнению с незараженных клеток, в соответствии с предыдущими докладами ^2,5. Аденовирус способ доставки Cre рекомбиназы выгодно как адено-Cre вирус легко доступны, и удаление гена с помощью Cre почти в 100% клеток может быть достигнуто за счет оптимизации аденовирусной инфекции.

Размораживание клетки

1. Получить замороженных мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs) (созданный ранее из отдельных эмбриона первичных культур) с жидким азотом.
2. Оттепель клетки путем погружения флакона в 37 ° С воду с закрученной пока содержимое полностью оттаять.
3. Добавить 9mL из DMEM, который был с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пенициллина стрептомицин к культуре пластины ячейки 10см.
4. Добавить талой клеточной суспензии по каплям к пластине, рок-пластинка аккуратно, чтобы разогнать клетки и поместить пластинку в 37 ° С, 5% СО ₂ инкубатора в одночасье. Заметим, что если клетки чувствительны к ДМСО (от замораживания процесса), начальные средства массовой информации может быть заменен на свежий СМИ после того, клетки присоединившимся к пластине (примерно четыре часа после покрытия). Также отметим, что слияние клеток после оттаивания зависит от количества клеток заморожены, скорость восстановления клеток после замораживания, а темп роста клеток.

Пассирования клетки

5. Когда клетки росли, чтобы по существу, 100% слияния (то есть: на следующий день), аспирация от средств массовой информации и промыть клетки с 5 мл стерильной PBS.
6. Удалить PBS и добавьте 1 мл трипсина содержащей 10 мМ ЭДТА и место пластину в инкубаторе в течение примерно 5 минут, чтобы дать клеткам отсоединиться от пластины.
7. Когда клетки имеют индивидуальный добавить 9mL средств массовой информации для трипсином клетки, пипетки 2-3 раза, чтобы разогнать скопления, добавьте 1 мл этой суспензии по каплям на новую пластину, содержащую 9mL средств массовой информации, и место это в 37 ° С инкубатор ночь . Наличие FBS в СМИ инактивирует трипсин альтернативно, клетки могут быть вымыты первый разбавить из трипсина.

Подсчет и покрытие клеток на покрытие проскальзывает

8. Удалить клетки из инкубатора, вымыть и trypsinize как и раньше, но на этот раз добавить 5-6 мл СМИ назад к трипсином клетки вместо 9mL.
9. Внесите клетки тщательно для обеспечения полной диссоциации в суспензии отдельных клеток, и удалить 15μL сочетать с 15μL трипановой синий в отдельной трубке отцентрифугировать.
10. Смешайте эту ячейку / трипанового синего подвески с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз, и добавить к 15μL гемоцитометра.
11. Под микроскопом, мертвые клетки появится синий. Подсчитайте количество очистки / бесцветный (живых) клеток в одном из 4X4 сеток на гемоцитометра. Повторите эту рассчитывать на три другие сетки 4X4 (обозначается A, B, C и D) и использовать следующее уравнение для расчета количества клеток в мкл подвеска:
    
12. Благодаря оптимизации протокола, мы определили, что покрытие 30000 клеток приводит к соответствующей плотности клеток для визуализации в конце эксперимента.
13. Чтобы рассчитать объем клеточной суспензии необходимое для 30000 ячеек используйте следующее уравнение:
    
14. Теперь место стерильную скольжения покровного стекла в каждую лунку шесть хорошо блюдо и добавить 2 мл среды в каждую лунку, а затем добавить по каплям из вашей клеточной суспензии объем, необходимый для 30000 клеток в каждую лунку. Обратите внимание, что скользит остекления используются для этого эксперимента, как мы будем визуализировать клетки с помощью флуоресцентной микроскопии на более позднем этапе, не все приложения будут обязательно требует микроскопии, и, таким образом покрытие не скользит могут потребоваться.

Вирус трансдукция

15. После нескольких часов или на ночь (достаточно времени для того, чтобы клетки придерживаются крышки слипы), удалить средства массовой информации и мыть клетки с 1 мл бессывороточной DMEM.
16. Добавить 1 мл сыворотки, свободных средств массовой информации в каждую лунку для добавления вируса. Для этого эксперимента, адено-вирус Cre было получено коммерчески Векторные Биолабс.
17. Предыдущая оптимизация протоколов показал, что множественность заражения (МВД) в 500 обеспечивает высокую эффективность генной трансдукции в первичные MEFs практически не влияет на жизнеспособность клеток. МВД может быть рассчитана следующим образом:
    
    
    
18. Добавить расчетный объем вирус непосредственно в каждую лунку, которая должна быть инфицированы, мягко рок пластины, чтобы рассеять вирус и поместить клетки в 37 ° С инкубатор в одночасье.
19. Следующим утром, удалить вирус-содержащих средств массовой информации из клетки и мыть клеток в 1 мл стерильной PBS, а затем добавить 2 мл регулярных средств массовой информации в каждую лунку.
20. В случае Rac1 клетки примером в этом эксперименте, морфологические изменения произошли в клетки примерно в 72 часа после трансдукции.

Представитель Результаты

Клетки визуализироватьг окрашиванием актина красителя фаллоидином (для работы с изображениями целей) и отображение использовании Leica TCS SP5-многофотонной конфокальной лазерной сканирующей микроскопии на Расширенный Центра анализа в Университете гвельфов. На рисунке 1 показан контракт и удлиненные морфологии Rac1 ^{FLOX / FLOX} клетки, которые подвергались адено-вирус Cre сравнению с тем же клетки не подвергаются воздействию вируса.

Рисунок 1. Сравнение Rac1 ^{FLOX / FLOX} клетки, инфицированные адено-вирус Cre (слева) по сравнению с незараженных клеток из того же источника (справа).

Сопровождающее видео пример того, как рекомбинантный вирус может быть использован для акцизных конкретных генов в пробирке использованием Cre рекомбиназы. Развитие этого протокола однако же выявить некоторые конкретные моменты стоит адресации.

• Надлежащие процедуры безопасности должны всегда быть использованы при работе с аденовирусы. Лабораторный халат и перчатки следует носить все время при работе с вирусом. Средства массовой информации и пластиковая посуда, следует относиться с 10% гипохлоритом натрия в течение 30 минут, и пластиковая посуда необходимо обрабатывать в автоклаве после этого.
• Избегать повторного замораживания-оттаивания вирус акции, поскольку это может повлиять титра вируса и тем самым снизить эффективность трансдукции. Небольшие объемы вирус акции должны быть первоначально аликвоты в отдельные пробирки.
• Mois в пределах от 50-500 были испытаны во время метод развития и эффективной ставки трансдукции наблюдались в большинстве случаев, без негативного влияния на жизнеспособность клеток.
• Адено-GFP был также использован во время разработки метода быстро экрана трансдукции эффективности. Этот контроль (или пустой вектор) должны быть проведены в течение эксперимента, чтобы вирусная инфекция сама по себе не приводят к клеточные изменения. Аналогичным образом, если иссечение floxed интересующего гена в клетках организма не приводит к какой-либо клеточных изменений (то есть изменения в морфологии или жизнеспособности), то заражение одного типа клетки с адено-GFP является важным управления для использования, чтобы продемонстрировать, что вирус трансдукции происходит.

Помимо изучения сигнальных каскадов в области культуры, адено-Cre подход был также занятых в естественных условиях условно удалить гены от экспериментальных животных ^3,4, и для обозначения конкретных популяций клеток в организме ^6. Аденовирус система может быть адаптирована ввести гены, кроме Cre рекомбиназы в клетки хозяина. Два главных преимущества использования данной доставки вектора являются его высокая эффективность трансдукции и доставки генов и отсутствие интеграции с ДНК хозяина. Тем не менее, поколение новых рекомбинантных аденовирусов может быть трудоемким. Протокол, описанный здесь, поэтому использует мощь аденовирусной системы за счет использования ранее разработанных адено-Cre вируса, и связи, что с нашим floxed аллель интересов, Rac1. С помощью этого условного выбить эксперимента, мы подтвердили, что трансдукция использованием адено-вирус Cre MEFs проведения floxed аллель Rac1 действительно причинить иссечение Rac1, ведущие к изменениям в клеточной морфологии характерно Rac1-дефицитных клеток ^2,5.

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Rizaldy Скотт в больнице Маунт Синай в Торонто, Онтарио за его дар первичной Rac1 ^{FLOX / FLOX} эмбриональных фибробластов мыши. Эта работа была поддержана операционной гранты NJ от Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR, СС 2009-93526) и естествознания и техники Научно-исследовательского совета Канады (NSERC, Р. Г. 327372-06). SH и МВ поддерживаются CGSMA и РКУ-М награды от CIHR и NSERC, соответственно.

Стив Холи и Мелани Уиллс способствовали в равной степени к этой статье.